распад перекисного раствора и выделение пузырьков кислорода. Похожие ферменты, называемые каталаза и пероксидаза, найдены во всех разновидностях живых или бывших живыми тканях, если только они не подвергались температурному воздействию или глубокой переработке. Таким образом, необработанное зерно, мука, опилки, дерево и т. д. будут разлагать перекись за короткое время. Это означает, что вам придется избегать контакта раствора перекиси с подобными материалами при хранении. Это также означает, что если вы хотите включить указанные материалы в состав питательной среды, вам придется удостовериться в том, что перед добавлением перекиси все компоненты среды были подвергнуты тщательной тепловой обработке с целью уничтожения перекисеразрушающих ферментов.
Я предпринимаю определенные меры для обеспечения чистоты раствора перекиси при его хранении. Перед забором перекиси я, в первую очередь, протираю пробку и верхнюю часть бутылки спиртовым раствором, чтобы удалить частицы, которые могут содержать живые микроорганизмы.
После этого я либо отливаю перекись в пастеризованный мерный цилиндр, либо отбираю раствор с помощью чистой, пастеризованной пипетки, снабженной на верхнем конце ватным тампоном-фильтром. Пипетки не нуждаются в автоклавировании, но их требуется, как минимум, обрабатывать в течение нескольких минут кипятком (заполняя выше верхней градуировочной отметки, но ниже ватного тампона), а затем остужать перед тем, как производить забор перекиси.
Градуированный цилиндр объемом 100 мл может послужить удобным сосудом для погружения 10 мл пипетки в кипяток. Нагревание убьет все живые организмы, а перекись уничтожит оставшиеся термоустойчивые споры. Я также слежу за тем, чтобы не допускать закручивания пробки на бутылке, если пробка контактировала с источником заражения.
Различия в концентрации перекиси, поступающей от производителей
Суровая правда жизни состоит в том, что 3 % (согласно этикетке на бутылочке) раствор перекиси водорода, приобретенный вами в аптеке или магазине, на самом деле может иметь несколько иную концентрацию. Концентрация может заметно отличаться как в сторону больших, так и в сторону меньших значений. В какой-то степени можно избежать недоразумений, если не покупать просроченную перекись, проверяя срок истечения ее годности на этикетке (если он указан) и покупая заведомо свежий раствор (например, на бутылках, которые покупаю я, указан только месяц истечения срока годности, а год — не указан). Тем не менее, даже указанный срок годности не дает абсолютной уверенности в том, что концентрация действительно составляет 3 %. Поэтому важно уметь измерять концентрацию перекиси в растворе. Простой способ такого измерения основан на разложении перекиси из пробного образца раствора и измерении количества высвобожденного кислорода, которое я осуществляю с помощью надувного шарика.
Вот мой способ измерения примерной концентрации перекиси:
Возьмите чистую пробирку (предпочтительно с отвернутым краем на горлышке или с накручивающимся колпачком), небольшой надувной шарик и ломтик гриба такого размера, который может быть легко помещен в пробирку. Ломтик можно вырезать из ножки гриба, а кожицу нужно снять, чтобы обнажить большое количество разрушенных клеток. Самые лучшие результаты получаются с молодыми, быстро растущими грибами. Если под рукой не окажется грибов, можно использовать кусочек банана или другого фрукта, покрытого кожурой. Понадобятся также раствор перекиси, резиновое колечко, пастеризованная измерительная пипетка, мерный цилиндр на 100 мл и кастрюлька с водой.
1. С помощью пастеризованной пипетки отберите 5 мл раствора перекиси из бутылки и перенесите его в пробирку.
2. Поместите ломтик гриба на верхнюю часть пробирки (пока не допускайте попадания ломтика в перекись).
3. Освободите шарик от воздуха и натяните его на горлышко пробирки (пробирку держите наклоненной, чтобы ломтик гриба не соскользнул в раствор, пока шарик не поставлен на место).
4. Зафиксируйте резиновым колечком шарик на горлышке пробирки, чтобы газ не начал выходить наружу по мере повышения давления (я считаю наиболее эффективным использовать резинку от порванного колечка, которой можно плотно обвязать шарик на горлышке пробирки).
5. После того, как шарик сел на место, стряхните ломтик в раствор перекиси. Раствор должен немедленно вспениться из-за выделения пузырьков кислорода.
6. Взбалтывайте пробирку. Раствор перекиси должен по большей части разложиться в течение пяти или десяти минут, в зависимости о количества каталазы/пероксидазы в грибном ломтике.
7. Когда разложение почти закончится, вы увидите, что выделение пузырьков замедлилось, а сами пузырьки стали довольно мелкими. Шарик, тем временем, должен подняться и стать упругим, т. к. он наполнится высвобожденным кислородом.
Со времен занятий по химии в колледже я помню, что 5 мл 3 % раствора перекиси водорода должны произвести примерно 4 9 мл кислорода, если перекись полностью разлагается при комнатной температуре и атмосферном давлении. Измерить количество кислорода, выделенного при разложении перекиси, можно в следующем порядке:
1. Наполните градуированный мерный цилиндр водой и поставьте его вверх ногами в кастрюлю с водой, удостоверившись, что в цилиндре нет пузырьков воздуха.
2. Перекрутите шарик у горлышка пробирки, чтобы кислород не выходил наружу, снимите шарик с пробирки, крепко удерживая скрученную часть, и поместите шарик под воду в кастрюле.
3. Аккуратно выпускайте газ из шарика в перевернутый мерный цилиндр так, чтобы газ замещал находящуюся в цилиндре воду.
4. Удерживая открытый конец мерного цилиндра под водой, определите по нанесенной на цилиндр шкале значение объема кислорода.
Когда я проделал такое измерение в первый раз, у меня получилось 52 мл газа внутри градуированного цилиндра от разложения 5 мл раствора перекиси. Учитывая, что в сдутом шарике перед началом измерения могло оставаться до 3 мл воздуха, раствор перекиси произвел количество кислорода, весьма близкое к теоретическому значению для 5 мл 3 % раствора.
Теперь рассмотрим, как вычисляется нужное количество раствора перекиси, если тест дает значения концентрации выше или ниже 3 %:
1. Разделите объем кислорода, ожидаемый от 5 мл 3 % раствора (4 9 мл, если шарик совершенно пустой или 52 мл, как в рассмотренном выше примере, учитывая несколько миллилитров воздуха, оставшихся в шарике) на объем кислорода, который вы действительно получили.
2. Умножьте предыдущее значение на объем раствора перекиси, который вы добавили бы к среде или субстрату, если бы это был 3 % раствор (это значение приводится в соответствующих разделах этой книги; например в разделе, посвященном агаровой культуре, вам будет нужно добавить 6 мл 3 % перекиси к 1 л стерилизованной агаровой среды).
Информация о точной концентрации перекиси наиболее важна, когда вы приготовляете агаровые чашки (см. ниже), так как вам придется работать с концентрациями, которые близки к нижнему порогу эффективности. При изготовлении посевного мицелия вы будете иметь дело с заметно более высокими концентрациями, так что возможностей для вариаций будет больше. Для приготовления основного субстрата я использую меньше перекиси, чем для посевного мицелия, но и в этом случае остается некоторая свобода для подбора концентраций. Я рекомендую производить тест с шариком для каждой новой бутылки с раствором перекиси, который используется для работы с агаром а также проверять перекись, который используется для посевного и основного субстрата,
