аккаунт в «Твиттере» (@tardigradopedia). Они выживают практически везде, даже в открытом космосе, переносят жесткое излучение и обезвоживание (высушивание). Такие экстремофильные способности тихоходок известны с начала XX в. Считается, что их устойчивость к обезвоживанию и облучению имеет одни и те же механизмы, но до сих пор остается загадкой, как эти малютки обзавелись такими потрясающими способностями. Как только в 2015 г. был секвенирован геном тихоходок, сразу несколько исследовательских групп (в том числе японские команды под руководством Ацуси Тоёды и Такекадзу Куниэды, а также группа из Северокаролинского университета во главе с Бобом Голдштейном) принялись разбираться в их суперсилах.
Считается, что высокая устойчивость тихоходок к рентгеновскому и прочему облучению – это побочный эффект адаптации к сильному обезвоживанию. Дело в том, что при высыхании организма большинство биомолекул в нем может повредиться или разрушиться. Подобно тому, как сухая кожа порой трескается, шелушится и даже кровоточит, в высыхающих клетках повреждаются молекулы. ДНК, РНК, белки и прочие компоненты внутриклеточной среды из-за быстрого обезвоживания могут разрываться и надламываться, как под действием рентгеновского излучения.
Как же в таком случае тихоходки справляются одновременно и с иссушением, и с жестким излучением? Как узнать, какие гены в наибольшей степени за это отвечают? Логичнее всего проследить, какие гены активируются при обезвоживании, и сосредоточиться именно на них. Так сначала и стал действовать Куниэда с коллегами. Но изменения экспрессии генов при обезвоживании и последующей регидратации не были сколько-нибудь значительными. Таким образом, тихоходка способна входить в состояние обезвоживания и без серьезных корректировок в работе генов. Учитывая это, исследователи предположили, что более перспективны поиски гена, характеризующегося постоянной экспрессией, – такие гены еще называют генами домашнего хозяйства. Дело в том, что они активны в клетке всегда, так как нужны для «поддержания порядка», и работают подобно неутомимым горничным.
Именно в таком ракурсе удалось выявить уникальные гены тихоходок. В большинстве своем они отличаются постоянной активной экспрессией, непрерывно производят белки. Кроме того, они активны как на этапе зародышевого развития, так и у взрослой тихоходки. Но среди десятков уникальных белков, продуцируемых этими специфичными для тихоходок генами, нашелся всего один Dsup – белок подавления ущерба (его называют радиопротекторный), который компактно расположен рядом с ядерной ДНК. Такая локализация явно указывала, что он может тесно взаимодействовать с ДНК и даже, возможно, защищать ее.
Затем были запущены два эксперимента. Первый был призван показать, в самом ли деле Dsup может повышать резистентность к облучению, а второй – сохранится ли такая защитная функция в совершенно новой среде, т. е. в человеческой клетке. Для этого сначала требовалось создать человеческие клетки, содержащие белок Dsup, а затем подвергнуть культуру воздействию рентгеновских лучей. Такие лучи могут вносить хаос в геном двумя путями. Необходимо отметить, что энергия излучения может либо напрямую поглощаться ДНК (непосредственное воздействие) и таким образом повреждать молекулу с наследственной информацией, либо действовать опосредованно, провоцируя выделение активного кислорода из молекул воды. При помощи методов генной инженерии, о которых мы поговорим ниже, японским исследователям удалось создать клеточную линию HEK293, где ген Dsup экспрессируется под контролем «конститутивного CAG-промотора». Поэтому он должен сохранять активность в человеческих клетках и делать их по свойствам похожими на клетки тихоходок.
Затем приступили к облучению. Как и ожидалось, под воздействием перекиси водорода (H2O2) в контрольной группе клеток HEK293 большая часть ДНК (71 %) претерпела сильную фрагментацию. В противоположность этому в клетках, экспрессирующих ген Dsup, фрагментация ДНК была в значительной степени подавлена: только 18 % от общего объема ДНК оказалось повреждено. Следовательно, можно заключить, что белок Dsup защищает клеточную ДНК как от активного кислорода, так и от рентгеновского излучения. В качестве эксперимента по «спасению» исследователи также попытались предварительно обрабатывать облучаемые клетки антиоксидантом N-ацетил-L-цистеином (NAC), который, как ожидалось, существенно купирует вызываемые пероксидом однонитевые разрывы ДНК. Но суперсилы этих веществ можно сочетать: при одновременном применении NAC и Dsup патологические изменения подавлялись еще эффективнее. Количество разрывов сокращалось на 40 %. Человеческие клетки, экспрессирующие Dsup, не только значительно меньше страдали от жесткого излучения, но и демонстрировали повышенную живучесть и способность к пролиферации (росту) после облучения.
Это был первый результативный опыт, когда ген тихоходок, внедренный в человеческую клетку для радиационной защиты, не ингибировал рост и не нарушал ни морфологию, ни базовые функциональные свойства клетки. Однако это было внедрение одного гена в одну клеточную линию. Трудно сказать, что могло бы произойти с целым человеческим организмом. Конечно, можно извлечь потрясающие уроки из таких экспериментов и из знаний о геномах слонов и тихоходок, но что нас ждет, если на этом не останавливаться? Как одновременно работать с большим количеством генов? Можно ли усовершенствовать этот метод?
Работа, проведенная в моей лаборатории в Корнеллском университете, показала, что полученное ранее 40 %-ное снижение ущерба для ДНК можно довести до 80 % или даже до 85 %, улучшая интеграцию и регуляцию гена Dsup, а также модифицируя другие гены в геноме человека. Именно в этом суть работ, намеченных на 2021–2040 гг., когда все человеческие гены превратятся в поле для создания новых человеческих генов и формирования новых функций в клетках.
Но для начала разберем, как это сделать.
Как сконструировать новую клетку
Если сравнить организм с миской бульона, то генетическое «преобразование» – это способ переноса ингредиентов бульона из одной миски в другую. Возможны разнообразные варианты генетической интеграции и трансформации, в том числе разные способы введения инородной ДНК в новую клетку. Есть методы, позволяющие выращивать ДНК в больших количествах при помощи бактериальных «пакующих клеток» и трансфекции, в основном касающиеся интеграции ДНК в эукариотические клетки. Некоторые из этих методов были разработаны в 1950-е и 1960-е гг., когда их применяли для переноса плазмид (небольших кольцевых молекул ДНК) от одних бактерий к другим (бактериальная трансфекция). Именно в то время были разработаны и первые протоколы клонирования для создания копий этих плазмид. Но, чтобы понять, как сконструировать клетку, сначала нужно научиться измерять то, что присутствует в ее геноме.
Новые методы появились в 1970-е и 1980-е гг., когда исследователи научились клонировать плазмиды и амплифицировать эти продукты при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это химическая реакция, при которой экземпляры участка молекулы ДНК постоянно удваиваются в количестве. Если в качестве мишени взять конкретную генетическую последовательность, а на ее «головном» и «хвостовом» кончиках использовать праймеры для затравки реакции, то копирование можно начать с единственного фрагмента ДНК. В результате из одного фрагмента получается два, из двух – четыре, из четырех – восемь и далее 2n. Этот простой метод, за который Кэри Муллис был удостоен Нобелевской премии, предвосхитил современную эру молекулярной биологии.
Действительно, ПЦР стала топливом, положившим начало эре «чтения геномов», когда ученые со всего мира вдохновились идеей и принялись амплифицировать ДНК всего, чего только хотели. Благодаря этим технологиям в 1995 г. Крейг Вентер получил первый бактериальный геном (гемофильная палочка), затем в 1999 г. Джеральд Рубин получил геном мушки дрозофилы. Затем последовали другие геномы. Когда есть возможность секвенировать ДНК организмов, можно начинать рассматривать на самом низком уровне, что происходит при операциях трансфекции и манипуляциях с геномом.
Известно, что, полежав на пляже в солнечный денек, одни получают красивый загар, а другие обгорают. Точно так же одни бактериальные клетки поддаются «трансформации» гораздо легче, чем другие. Преобразовать некоторые клетки не составляет труда: они с готовностью поглощают ДНК из окружающей среды. С другими процесс идет сложнее. Так, Deinococcus radiodurans известен тем, что очень быстро инкорпорирует генетический материал и сразу использует его. Еще один вид бактерий, впитывающих ДНК как губка, – кишечная палочка E. coli, давно зарекомендовавшая себя как столп современной молекулярной биологии.
Однако большинству организмов не нравится вторжение чужеродной ДНК. На клеточном уровне такое событие можно сравнить с инцидентом: вы едете в метро – и вдруг незнакомец засовывает вам в рот сосиску. Например, у растений есть встроенная жесткая клеточная стенка из целлюлозы, препятствующая проникновению внутрь клетки чужой ДНК. У эукариотических клеток (в частности, человеческих) имеются активные ферменты, именуемые ДНКазами[6]. Также в клетках предусмотрены механизмы
