в понимании системы CRISPR. Именно широкомасштабное внедрение технологии секвенирования (напомним, что это специальный технологический процесс чтения генома, последовательности нуклеотидов ДНК) и компьютерного анализа генетического текста, который сегодня составляет отдельное направление исследований под названием биоинформатика, позволили сделать этот шаг.
Группа испанских ученых с помощью биоинформационных подходов анализировала геномы бактерий, которые уже были секвенированы и генетические тексты которых находились в базах данных, и обнаружила там коротенькие фрагменты бактериофагов — вирусов бактерий, разделенных «или», «упала на лапу». Как говорили раньше, произошло «открытие на кончике пера», только теперь вместо пера были принтер и компьютер. Две группы из Франции совершенно независимо секвенировали уже другие бактериальные геномы, которых еще не было в базах данных, и тоже обнаружили там маленькие кусочки генетического текста бактериофагов, разделенные повтором «или», «а роза азора» либо другими. Пазл понемногу начинал складываться. У бактерий в геноме есть фрагменты генетического текста их врагов — бактериофагов, то есть вирусов бактерий. Кусочки текста короткие, два десятка нуклеотидов. Это не то, что обнаружил Ледерберг, когда описывал интеграцию целого бактериофага в геном бактерии. Да и не одному бактериофагу принадлежат эти кусочки — они относятся к абсолютно разным бактериальным паразитам, которых у бактерий, как и у нас, великое множество. Это маленькие фрагменты чужого текста, разделенные палиндромами. Исследователи одной из французских групп заметили, что те штаммы бактерий, которые имели в своем геноме фрагмент бактериофага А, оказывались к нему устойчивы, не погибали. Те, которые имели фрагмент от Б, были устойчивы к Б. Но только вторая группа французских исследователей, обнаружив такое же явление, предположила, что в формирование этих структур вовлечена фрагментация (нарезание) ДНК продуктами генов с нуклеазной активностью, которые находились рядом с кластером CRISPR, поэтому соответствующие гены получили название CRISPR associated (ассоциированные с CRISPR), или Cas-гены. Более того, исследователи даже предположили, что это все нужно бактериальной клетке для борьбы с чужеродной ДНК. Это была их гипотеза. Доказательств еще не было, но уже предвиделась роль CRISPR/Cas.
НЕМНОГО ИСТОРИИ
Хочется немного остановиться на исследователях из второй французской группы. В нее входили два русских ученых — Александр Болотин и Алексей Сорокин, с которыми мне пришлось начинать карьеру в восьмидесятые годы, в бытность мою еще студентом Московского инженерно-физического института. Тогда мы встретились во Всесоюзном научно-исследовательском институте (ВНИИ) генетики и селекции промышленных микроорганизмов Главмикробиопрома СССР. Было такое ведомство, которое, помимо разработки штаммов микроорганизмов для медицины, сельского хозяйства и пищевой промышленности, должно было в случае необходимости в кратчайшие сроки переориентировать биотехнологические производства на выпуск микроорганизмов для биологического оружия. Но мы во ВНИИ генетики занимались мирными исследованиями по генной инженерии микроорганизмов и растений.
В лихие годы перестройки, когда ни генетика, ни медицина, ни питание не интересовали никого, все, кто мог, были увлечены растаскиванием имеющегося имущества, меньшая часть населения решила продолжить свою профессиональную деятельность, но там, где она востребована. Тогда много талантливых ученых покинули СССР для научной работы в странах Европы и Америки. Александр и Алексей работали в одной лаборатории ВНИИ генетики, и сначала Алексей уехал во Францию, чуть позже к нему присоединился Александр и еще несколько человек. После отъезда Саши Болотина я увиделся с ним в Новосибирске на конференции «Фундаментальные науки — медицине» в 2007 году. Мы встретились, как будто вчера расстались, и отлично провели время, засиживаясь чуть ли не до утра за разговорами. Александр тогда докладывал о новых открытиях в области CRISPR, а я, к своему сожалению, в то время совершенно не оценил важность этого открытия. У меня были свои интересы и увлечения: генная терапия, стволовые клетки человека; мне казалось, что это очень далеко от бактерий и бактериофагов.
Казус компании Danone
Одной из компаний, давно применявших вирусы бактерий, является всем известная Danone, которая снабжает нас творожками и йогуртами под этим же торговым названием. Она активно использует бактериофаги в молочной продукции. Это делается для того, чтобы продукция, которую мы покупаем в магазине, была строго стандартизирована и сертифицирована. Любой творожок должен пройти правильный путь молочно-кислого брожения, и йогурты должны содержать только правильные микроорганизмы, чтобы получить определенный вкус. Во всех магазинах всех стран и городов продукция компании Danone не должна отличаться по качеству ни сегодня, ни завтра. Стандарт!
НЕТ В МИРЕ СОВЕРШЕНСТВА
Но представьте себе, что вы вылили ведро закваски в чан с пятьюдесятью тоннами молока. Перед тем как разлить продукт по баночкам и пустить на конвейерную упаковку, подходит дегустатор-биохимик и берет анализ. Проверяет — ба, это что ж такое? В свежем молочном продукте, кроме тех бактерий, которые были влиты в составе закваски, размножились еще какие-то! Продукт сброжен немножко по-другому, вкус чуть-чуть отличается от стандартного. Это плохо, ведь потребитель хочет, чтобы было так, как он привык. Мало того, могут измениться сроки хранения. А если йогурт скиснет раньше времени? А вдруг произойдет еще какая-нибудь неприятность, которую этот случайный попутный штамм бактерий может вызвать?
Увы, нет в мире совершенства. Иногда закваски чуть-чуть отклоняются от стандарта или молоко в чане может содержать небольшую долю случайно привнесенных бактерий. Это известная технологическая проблема.
Однако с проблемой попутных штаммов технологи научились бороться следующим образом. Специалисты выяснили, какие попутные, неправильные, ненужные нам бактерии появляются наиболее часто. И против них были найдены и выделены определенные бактериофаги, которые их убивали. При этом нужные микроорганизмы этими бактериофагами не инфицировались и чувствовали себя спокойно.
Вроде бы простое с технологической точки зрения производство, но какие там сложные взаимоотношения! Этот технологический процесс, который использовала компания Danone, отлично работал.
Но внезапно у Danone возникли серьезные проблемы. Работники компании обнаружили, что те бактериофаги, которые использовались в этом казалось бы стандартном технологическом процессе, перестали убивать ненужные бактерии. И творожки с йогуртами стали выходить скисшими, тухлыми, многие пошли в брак. Но почему?
Руководители Danone обратились за помощью к ученым. По случайности это исследование опять проводилось во Франции. Исследователи стали изучать бактерии Streptococcus thermophilus, которые наиболее часто используются для закваски, и устойчивость этого штамма к двум типам бактериофагов. Обнаружилось, что микроорганизм становится устойчив
