Мы не были оптимистично настроены. Отыскать человеческие кости эпохи палеолита случается очень редко; почти все найденные кости принадлежали животным. Время от времени попадаются скелетные обломки или отдельные зубы, но этого крайне мало по сравнению с останками животных, которых люди-охотники и хищные звери заносили в пещеры. Принесет ли пользу просеивание всех этих бесчисленных осколков костей? В конце концов, в ходе небольшого застолья, которое организовал Анатолий Деревянко, когда все немного разгорячились от водки, мы завели разговор на эту тему. Анатолий и Михаил Шуньков сочли идею разумной. Сванте Паабо также был очень заинтересован ею; он сразу понял, что, учитывая высокий уровень биомолекулярной сохранности находок в Денисовой пещере, таким способом можно будет раздобыть значительно больше человеческих костей, пригодных для генетического секвенирования. Итак, нам дали зеленый свет. Анатолий заверил нас, что к следующей встрече, которая должна была состояться на конференции в Бургосе (Испания) в том же году, они с Михаилом приготовят для нас мешок костей, чтобы мы могли приступить к работе.
Что касается гоминин, то ZooMS могла рассказать нам, принадлежал ли обладатель кости к семейству гоминидов, и ничего больше[36]. Иными словами, масс-спектрометр выявит у гориллы, неандертальца, денисовца, орангутана и у нас с вами одинаковую последовательность пептидов. Для дальнейшего обнаружения различий и верной идентификации образца необходимо извлечь и секвенировать ДНК. Этот этап работы должен был обеспечить Сванте со своей прославленной исследовательской группой.
Рис. 16. Сванте Паабо (слева) и автор у входа в Денисову пещеру в 2014 г.
В тот приезд в Денисову пещеру я впервые смог обстоятельно пообщаться со Сванте. Прежде мы лишь однажды пересекались – в начале 2000-х гг., в оксфордском пабе среди большой толпы. То ли дело в Денисовой пещере, на небольших встречах участников исследования, где действительно знакомишься с коллегами и общаешься с ними. Почти 10 лет я разъезжал по раскопкам и музеям, откуда доставлял в лабораторию многочисленные образцы для датировки. Каждый раз, забирая кость неандертальца для радиоуглеродного исследования, я спрашивал у хранителей, не произвести ли им заодно и секвенирование ДНК образца, на что неизменно получал ответ: «Этим уже занимается Сванте, в Лейпциге». Я привык к подобным разочарованиям. Конечно же, дело в том, что Паабо и его группа являются специалистами по неандертальцам, а теперь еще и по денисовцам. К тому же самыми лучшими.
Сванте начал исследовать древнюю ДНК практически в одиночку, в 1980-х гг., в лаборатории Аллана Уилсона в Беркли. А сейчас возглавляемый им лейпцигский отдел Института Макса Планка является мировым лидером в области древней геномики. У этого рослого и немного неуклюжего шведа, то и дело повторяющего: «Очень круто!», замечательное чувство юмора. Мы с ним хорошо поладили и теперь приходимся друг другу не только коллегами, но и добрыми друзьями. У него блестящий ум, и все же он немного не от мира сего[37].
Отдел Сванте ежегодно устраивает семинары для обсуждения своих исследований. Однажды и я стал гостем такого семинара, проходившего в хорватском городе Пула. Было крайне поучительно наблюдать, как личные научные интересы Сванте сочетаются с устремлениями его сотрудников. Он возглавляет группу из очень талантливых, сложившихся ученых и многообещающих студентов.
Мысль об испытании ZooMS на денисовских образцах удачно совпала с получением мною крупного гранта от Европейского исследовательского совета (ERC)[38]. Даже часть от этой суммы позволяла нам обработать с помощью ZooMS несколько тысяч образцов, и потому, вернувшись в Оксфорд, мы приступили к подготовке мелких фрагментов костей для исследования. Этот первый этап длится дольше всего. Нужно отпилить от каждой косточки препарат – маленький, около 20 мг, кусочек, поместить его в пластиковую пробирку и пометить ее так же, как пластиковый пакет, в котором хранится исходный образец.
Далее следует химическая обработка.
Сначала мы извлекаем белок (коллаген), растворяя кость в разбавленной кислоте. Полученный коллаген необходимо разделить на отдельные пептиды. Это мы делали при помощи еще одного передового метода, суть которого состоит в добавлении в коллагеновый раствор фермента трипсина, с хирургической точностью разрезающего коллаген на фрагменты-пептиды. (Вообще-то, именно этим трипсин занимается в животе каждого из нас, помогая нам переваривать белки. Когда вы съедаете бифштекс, вы запускаете тот же самый процесс ферментного переваривания, который мы применяем в лаборатории для того, чтобы выбрать из находок археологов человеческие кости.) Выделив пептиды, мы добавляем химикат, который обеспечивает их затвердение и кристаллизацию, после чего многоканальной пипеткой наносим вещество на множество – сотни – стальных пластинок. Эти пластинки мы помещаем в масс-спектрометр.
С помощью лазера пептиды получают электрический заряд, и заряженные частицы движутся по короткой трубке к детектору. Чем мельче фрагмент, тем быстрее его движение, крупные же обязательно отстанут. Очень скоро массы всех частиц пептидов, имеющихся в образце, удается измерить, после чего полученное распределение сравнивают с библиотекой исследованных ранее костей, принадлежность которых точно известна, и таким образом образец идентифицируют до рода, а иногда и до вида.
Подготовительная стадия исследования весьма трудоемка – для нее нужны очень старательные работники. Мы с Катериной задумались, может ли кто-нибудь из наших студентов заинтересоваться выполнением проекта по одной из тем их диссертации. К счастью для нас, в тот год подобралась сильная когорта студентов-магистрантов, и одна из студенток, энергичная и целеустремленная австралийка Саманта Браун, решила написать магистерскую диссертацию именно об этой работе.
Сэм принялась пилить кости. Она целыми днями не показывалась из комнатушки нашей оксфордской лаборатории и к концу января приготовила 700 10-миллиграммовых препаратов. В середине февраля 2015 г. она побывала на стажировке в манчестерской лаборатории Майка Бакли, где занималась анализом образцов и училась идентифицировать пептидные последовательности.
Через неделю спектральный анализ показал, что кости, которые мы успели исследовать, принадлежали медведю, корове, оленю, собаке, лисице, козе, лошади, гиене, мамонту, мыши, кролику, северному оленю, шерстистому носорогу и овце. А вот гоминидов не попадалось. Первая проба оказалась неудачной. Я запретил себе думать о том, что фактически мы ищем иголку в стоге сена – ну то есть в груде костей. Результата не было, но мы все же попытались. Я чувствовал, что пора освободить Сэм от этого задания. Она проделала большую работу и получила определенные данные, но попасть в яблочко, на что мы так надеялись, ей не удалось.
Мы встретились с Сэм, чтобы обсудить ее достижения. Я сказал, что она собрала солидный массив материалов об идентифицированных костях животных, который, пожалуй, послужит отличной базой для диссертации. Так что она может отдохнуть и не спеша составить тезисы к положенному сроку.
Рис. 17. Схема использования метода ZooMS для выявления человеческих костей
Но тут Сэм проявила твердость характера. Она отказалась и заявила, что не желает бросать работу, а хочет продолжить ее и обработать максимальное число образцов, среди которых все же может попасться кость гоминина. Ну можно?..
Средства пока что позволяли – так почему бы и нет? Единственная проблема состояла в том, что у нас закончились образцы, и поэтому мы отправили Сэм в Россию. Через несколько дней она вернулась оттуда с еще одним большим мешком костных обломков, любезно предоставленных нашими русскими коллегами, и снова скрылась в своей «мастерской». Через три недели были напилены, промаркированы и готовы к исследованию 1308 препаратов.
