Степень «жесткости» альдегидной фиксации и пригодность архивного материала для ИГХ-исследования удобно контролировать, используя тест-реакцию с моноклональными антителами к виметину (клон V9). Антитела клона V9 выявляют чувствительный к перефиксации эпитоп этого белка ПФ. Поскольку клетки, содержащие виментин (фибробласты, эндотелиоциты, менингоциты и др.), присутствуют в любом гистологическом объекте, за редким исключением, отрицательные результаты пробной ИГХ-реакции на виментин будут указывать на малую пригодность материала для ИГХ в целом. При обезвоживании материала не следует применять изопропанол, который делает объекты хрупкими и плохо поддающимися резке на микротоме. В качестве промежуточных сред могут быть использованы: хлороформ, петролейный эфир, ортоксилол, метилсалицилат, метилбензоат, неоптическое кедровое масло, пихтовое масло, терпинеол. Заливку можно проводить, используя парафин любых коммерческих марок, лучше известных производителей, как отечественных, так и зарубежных. При этом не следует применять парафин с высокой температурой плавления (58 – 60 °C). При заливке не рекомендуется использовать температуры выше 60 °C.
Заливка в целлоидин и целлоидин-парафин нежелательна, так как приводит к развитию неспецифической фоновой окраски в ходе выявления пероксидазы диаминобензидином. В случае необходимости применения целлоидина перед постановкой реакций его следует удалить из срезов жидкостью Никифорова (спирт-эфиром).
Изготовление срезов для ИГХ-исследования следует проводить на надежных ротационных и санных микротомах, обеспечивающих точную подачу и необходимый диапазон толщины срезов (3 – 7 мкм). Более толстые срезы могут потребовать модификации протоколов ИГХ-обработки и изменения времени демаскирования антигенов. Кроме того, толстые срезы плохо удерживаются на предметных стеклах даже при использовании специальных адгезивов. Срезы должны быть хорошо расправлены. Отсутствие складок позволяет обеспечить лучшее прилипание к предметному стеклу.
Для того чтобы избежать неспецифической фоновой реакции при наклейке срезов на предметные стекла, не следует использовать в качестве адгезивов яичный альбумин и сыворотку крови. Обычно расправленные на дистиллированной воде срезы толщиной до 5 мкм хорошо приклеиваются к ничем не обработанным предметным стеклам импортного производства (например, к стеклам фирм «Shandon» (США) и «Menzel» (Германия)). При необходимости обычные предметные стекла для улучшения прилипания срезов могут быть обработаны специальными адгезивами (см. Приложение 2).
При расправлении и сушке срезов нежелательно применять высокие температуры (выше 48 °C). Оптимальным является просушивание срезов в суховоздушном термостате с вентиляцией при 40 °C в течение 3 дней. Более продолжительное пребывание срезов в термостате может способствовать лучшему их приклеиванию к предметным стеклам. При необходимости работы с препаратами на следующий день после изготовления срезов желательно использовать стекла с адгезивным покрытием, нанесенным в заводских условиях.
Потеря срезов во время проведения теплового демаскирования и длительной инкубации с антителами, когда нельзя изготовить новые срезы (весь блок уже порезан), ставит вопрос о принципиальной возможности улучшения прилипания срезов к предметному стеклу на этапе, когда срезы уже находятся на нем. Эту проблему можно попытаться решить, прогревая предметные стекла со срезами в течение ночи (перед проведением ИГХ-реакции) в термостате при 60 – 65 °C. При использовании такого способа достигаемое иногда улучшение приклеивания срезов сопровождается некоторой потерей иммунореактивности, вызванной действием на срезы высокой температуры.
Удаление парафина из срезов и их регидратацию перед иммуногистохимическим исследованием проводят так же, как и перед обычной окраской. При этом следует проверять спирты на загрязнение ксилолом, поскольку остатки ксилола, как и плохо удаленный парафин, могут приводить к понижению чувствительности реакции. Заменители ксилола следует использовать с осторожностью, поскольку они медленнее отмываются в спиртах и быстрее загрязняют их, чем ксилол.
Литература
Коржевский Д. Э. Использование моноклональных антител к ядерному белку PCNA для выявления пролиферирующих клеток в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2000. – Т. 118, № 5. – С. 68 – 70.
Коржевский Д. Э. Макрофаги сосудистого сплетения конечного мозга эмбриона человека // Морфология. – 2001. – Т. 119, № 1. – С. 20 – 23.
Коржевский Д. Э., Гилерович Е. Г., Зинькова Н. Н. [и др.]. Иммуногистохимическое выявление нейронов головного мозга с помощью селективного маркера NeuN // Морфология. – 2005. – Т. 128, № 5. – С. 76 – 78.
Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Отеллин В. А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях // Морфология. – 2006а. – Т. 129, № 1. – С. 85 – 86.
Коржевский Д. Э., Отеллин В. А. Морфологические основы формирования гематоликворного барьера сосудистого сплетения головного мозга в пренатальном онтогенезе человека // Журн. эволюционной биохимии и физиологии. – 2001. – Т. 37, № 2. – С. 150 – 153.
Коржевский Д. Э., Отеллин В. А., Неокесарийский А. А. [и др.]. Организация и цитохимические особенности барьерных структур плаценты человека // Морфология. – 2006б. – Т. 129, № 3. – С. 63 – 64.
Коржевский Д. Э., Талантова О. Е., Павлова Н. Г. Экспрессия белка bcl-2 в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2002. – Т. 122, № 5. – С. 31 – 34.
Глава 5.
ДЕМАСКИРОВАНИЕ АНТИГЕНОВ
5.1. Почему необходимо демаскирование антигенов?
В процессе фиксации тканевые антигены претерпевают конформационные изменения, связанные с коагуляцией белков и образованием перекрестных сшивок при воздействии альдегидов (формальдегида и глутарового альдегида) (Fraenkel-Conrat H. [et al.], 1947; 1948). Эти изменения во многих случаях приводят к маскировке антигенных детерминант, с которыми должны взаимодействовать полученные антитела к данным белкам. В результате оказывается, что при постановке иммуногистохимических реакций на фиксированном материале часть антител проявляет недостаточно высокую активность и окрашивание конечного продукта реакции слишком слабое либо вообще отсутствует. Степень повреждения антигенов зависит от условий фиксации и концентрации альдегидов в фиксирующей жидкости. Считается, что коагулирующие фиксаторы (спирты, уксусная кислота, соли металлов) вызывают меньшую потерю антигенных свойств, чем формальдегид. Хуже всего идут иммуноцитохимические реакции на препаратах, фиксированных глутаральдегидом.
Долгое время эта ситуация создавала неразрешимую проблему для использования в иммуногистохимической диагностике материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин – стандартный патологоанатомический материал. При необходимости иммуногистохимического исследования приходилось использовать замороженный нефиксированный материал или методы мягкой фиксации (холодный ацетон и др.). В настоящее время решение найдено. Восстановить антигенные детерминанты, которые были изменены при взаимодействии с формальдегидом, в большинстве случаев позволяет высокотемпературная обработка срезов в водных буферных растворах (Shi S. R. [et al.], 1991). Этот метод получил название «тепловое демаскирование антигенов». В англоязычной литературе он обычно называется heat-induced epitope retrieval. Следует отметить, что теоретические основы этого метода пока не разработаны. До сих пор непонятно, почему обработка материала при температуре свыше 100 °C приводит к восстановлению антигенных свойств белков, а не к их денатурации и дальнейшему разрушению антигенных детерминант. Тем не менее многочисленные исследования показывают высокую эффективность процедуры теплового демаскирования (Taylor C. R. [et al.], 1996; Evers P. [et al.], 1998; Kоржевский Д. Э. [и др.], 2005; Сухорукова Е. Г. [и др.], 2012). Причем метод оказался пригоден не только для парафиновых срезов, но и для материала, залитого в целлоидин (Shi S. R. [et al.], 1992a; 1992b; 1993), и даже для срезов, полученных с блоков, залитых в эпоксидные смолы.
В настоящее время разработано множество модификаций способа теплового демаскирования антигенов. Общим для них является прогрев срезов, приклеенных к предметным стеклам, в водных растворах до температуры 95 – 100 °C, а в отдельных случаях – и до 120 °C при повышенном давлении.
5.2. Растворы, применяемые для теплового демаскирования антигенов
С учетом эмпирически установленных особенностей процесса демаскирования в качестве растворов могут быть использованы водные растворы солей различных металлов и буферные растворы при различных pH. Считается, что, помимо гидролиза межмолекулярных связей, образованных благодаря действию фиксаторов, эффективность теплового демаскирования зависит от полноты удаления из срезов ионов кальция. Это достигается введением в буферные растворы солей лимонной кислоты или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, Трилон Б).
