Трихлоруксусная кислота. Применяют 5 – 10 %-й водный раствор этой кислоты, который одновременно фиксирует материал. К раствору целесообразно добавлять 10 – 20 %-й раствор формалина. Декальцинацию в трихлоруксусной кислоте рекомендуется проводить после предварительной фиксации в формалине, жидкости Буэна. Для декальцинации небольших кусочков достаточно 1 – 4 дней. Материал промывают в 96 %-м спирте в течение 3 – 4 дней, ежедневно меняя его. Для промывки нельзя использовать воду, иначе произойдет очень сильное набухание соединительной ткани.
Жидкость Дженкинса. Состав: 4 мл концентрированной соляной кислоты, 3 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл дистиллированной воды, 73 мл 100 %-го спирта и 10 мл хлороформа. Кусочки костной ткани декальцинируются в этом растворе 2 – 4 сут при 20 °C.
После декальцинации материал промывают в двух порциях абсолютного спирта, меняя его каждые 4 ч. Перед заливкой в парафин или целлоидин спирт удаляют, промывая объекты в 2 порциях хлороформа (по 3 мин). После декальцинации в жидкости Дженкинса не происходит набухания коллагеновых волокон, срезы костной ткани хорошо окрашиваются.
Жидкость Рихмана – Гельфанда – Хилла. Декальцинирующая жидкость состоит из 100 мл 90 %-й муравьиной кислоты, 80 мл 38,8 %-й соляной кислоты (удельный вес 1,19) и 820 мл дистиллированной или водопроводной воды. Объем декальцинирующей жидкости должен значительно превышать объем декальцинируемого объекта (в 10 – 20 раз). Небольшие кусочки компактной кости (1 – 2 г) декальцинируются при температуре 24 °C за 12 – 24 ч. В практической работе (за исключением декальцинации зубов) ее можно рекомендовать как мало меняющую тинкториальные свойства тканей и не вызывающую их набухания.
2.3. Декальцинация при иммуногистохимическом исследовании
При проведении иммуногистохимического исследования необходимо использовать более мягкие (или щадящие) методы декальцинации, поскольку быстрая декальцинация в растворах кислот приводит к изменению тканевых антигенов и появлению артефактов. Поскольку декальцинирующие растворы, применяемые при иммуногистохимических исследованиях, медленно удаляют соли кальция из объектов, продолжительность декальцинации существенно увеличивается и может быть сокращена только при уменьшении объема декальцинируемого объекта.
Декальцинацию для иммуногистохимии проводят в течение 5 – 30 сут в зависимости от объема и плотности костной ткани. В процессе декальцинации раствор желательно сменить несколько раз.
Фиксатор-декальцинатор формалин/этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). Состав: EDTA, динатриевая соль – 5,5 г; дистиллированная вода – 90 мл, формальдегид (37 – 40 %) – 10 мл. В этом растворе объекты можно не только декальцинировать, но и фиксировать, если для дальнейшего исследования пригодна формалиновая фиксация.
Декальцинирующий водный раствор EDTA. Состав: EDTA, динатриевая соль – 250 г, дистиллированная вода – 1750 мл. Этот раствор имеет pH 7,0 – 7,4. Если раствор мутный, нужно довести рН до 7,0 с помощью NaOH. При этом раствор должен стать прозрачным. Раствор используется после предварительной фиксации объектов.
Декальцинация маленьких объектов (Merchan-Perez А. [et al.], 1999).. Состав: аскорбиновая кислота – 1 г, хлорид натрия – 0,85 г, дистиллированная вода – 100 мл. Декальцинация этим раствором рекомендована при иммуногистохимическом изучении малых фрагментов костной ткани структур внутреннего уха (Merchan-Perez А. [et al.], 1999). Этот декальцинирующий раствор готовится непосредственно перед использованием и не может долго храниться.
2.4. Контроль эффективности декальцинации
Контроль за ходом декальцинации осуществляют в сочетании с заменой декальцинирующей жидкости. При использовании в качестве декальцинаторов слабых кислот тестирование на завершение декальцинации обычно проводят ежедневно. Для контроля последнего используют различные тесты (Некачалов В. В., 2000). Наиболее простыми являются пробный надрез, прокалывание кусочка препаровальной иглой. Для выполнения тестов требуется некоторый практический опыт, так как ни один из тестов не может быть признан удовлетворительным.
Химические тесты основаны на определении содержания кальция в декальцинирующей жидкости. Кальций-оксалатный метод позволяет обнаруживать в ней кальций за счет преципитации нерастворимых гидроокиси и оксалата кальция. Берут 3 мл использованной декальцинирующей жидкости, опускают в нее маленький кусочек лакмусовой бумаги и добавляют по каплям концентрированный (25 %) водный раствор аммиака до тех пор, пока раствор не станет нейтральным (взбалтывают после добавления каждой капли). Затем добавляют примерно 5 мл насыщенного при комнатной температуре раствора оксалата аммония, хорошо взбалтывают и оставляют на 30 мин. Образование преципитата свидетельствует о том, что в декальцинирующей жидкости имеется значительное количество кальция. Если исследуемая жидкость остается прозрачной в течение 30 мин, то декальцинация завершена.
ЛИТЕРАТУРА
1. Некачалов В. В. Патология костей и суставов. – СПб.: Сотис, 2000. – 285 с.
2. Merchan-Perez A., Gilloyzaga P., Bartolome M. V. [et al.]. Decalcification by ascorbic acid for immuno- and affinohistochemical techniques on the inner ear // Histochem. Cell Biol. – 1999. – Vol. 112. – P. 125 – 130.
Глава 3
ОБЕЗВОЖИВАНИЕ ОБЪЕКТОВ И ЗАЛИВКА В ПАРАФИН
3.1. Обезвоживание материала
Обезвоживание фиксированных объектов обязательно предшествует их заливке в парафин. Из фиксированных объектов можно готовить срезы и без заливки при помощи замораживающего микротома (замораживающего столика) и вибратома.
Перед обезвоживанием материала производят подготовку фиксированных кусочков органов и тканей для гистологического исследования (вырезку). Вырезанные кусочки должны иметь толщину не более 0,8 см (оптимально – 0,3 – 0,5 см), длину и ширину в пределах 1,5 – 2,0 см, т. е. не более длины сторон стандартного покровного стекла. При использовании для проводки гистологических кассет размеры кусочка ткани ограничиваются размерами кассеты. Не рекомендуется изготавливать слишком крупные кусочки, так как если они будут плотно прилегать к стенкам кассеты, то пропитка материала растворами в этом месте будет плохая. Также не рекомендуется складывать несколько кусочков тканей в одну кассету, поскольку они могут слипнуться и плохо пропитаться.
Перед проводкой материала кусочки органов и тканей, которые были фиксированы в формалине, промывают в проточной воде (до 24 ч) и подсушивают на фильтровальной бумаге.
Для обезвоживания материала обычно используют несколько порций этилового спирта восходящей крепости. Для материала, фиксированного в формалине, рекомендуется начинать с 70 – 80 %-го этанола, в котором объекты могут находиться длительное время без существенного сжатия и изменения тинкториальных свойств. Кроме этанола для обезвоживания может быть применен безводный ацетон, изопропанол, диоксан, глицерин. Обезвоживание ускоряется при постоянном перемешивании жидкости, которое обеспечивают автоматизированные системы проводки карусельного типа (Sakura Rotary Tissue Processor, Leica TP1020, Microm STP 120, АТ-5).
Продолжительность пребывания объектов в спирте обусловлена их размерами, свойствами тканей и особыми задачами исследования (например, необходимостью максимального удаления липоидов из нервной ткани перед заливкой в целлоидин и окраской по Нисслю).
Для обезвоживания кусочков обычного размера (1,0 – 2,0 × × 1,0 – 1,5 × 0,5 – 0,8 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки (при комнатной температуре без постоянного перемешивания).
Первая схема:
– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;
– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;
– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;
– этанол абсолютный – 6 – 24 ч.
Вторая схема:
– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;
– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;
– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;
– этанол 96 %-й (III) – 18 – 24 ч.
Третья схема:
– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;
– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;
– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;
– метилсалицилат (или метилбензоат) – этанол 96 %-й (1: 1) – 2 ч;
– метилсалицилат (или метилбензоат) – 12 – 24 ч.
В метилсалицилате материал можно долго хранить без ухудшения качества препаратов (Коржевский Д. Э., 1996; Коржевский Д. Э. [и др.], 2008). Так как проводка через метилсалицилат и метилбензоат приводит к смягчению плотных объектов, ее полезно использовать при обработке кусочков кожи и органов, содержащих много мышечной и соединительной ткани.
Ускорения процесса обезвоживания можно добиться, вырезая кусочки тканей меньшего размера (например, 1,0 × 0,5 × 0,2 см), обеспечивая постоянное перемешивание растворов (например, в автоматизированной системе гистологической проводки) и проводя обезвоживание при 37 °C в термостате. Большее повышение температуры растворов не рекомендуется в связи с опасностью сжатия и чрезмерного уплотнения тканей. Плотные объекты (кожа, декальцинированная кость) не следует обезвоживать при повышенной температуре.
