Человеческий разум сумел освободить клетки от их зависимости от хозяина-организма. Количество различных типов клеток, которые можно было выращивать в пробирках, стремительно нарастало. Достаточно скачать, что сейчас в мире счет различных линий клеток, культивирующихся вне организмов, идет уже на тысячи. Непростой груд для простого поддерживания такой гигантской коллекции грозил постепенно поглотить все свободное время исследователей и лаборантов.
Необходим был надежный способ надолго законсервировать клетки, да так, чтобы они сохраняли все свои уникальные свойства. Способ, который позволил бы в любое время получить для работы нужную линию клеток из уже имеющегося арсенала. Таким способом во всем мире стала криоконсервация и создание криобанков.
Kryos на греческом означает «холод», «лед», «мороз». Способность живых организмов при низких температурах как бы приостанавливать протекание всех биологических процессов, впадать в анабиоз, была известна людям еще издревле. Три века назад знаменитый итальянский естествоиспытатель Ладзаро Спалланцани занялся изучением, влияния отрицательных температур на живые организмы. Он установил важную связь между высушиванием и охлаждением.
Без воды нет жизни. Эта же самая вода из друга превращается в страшного врага для любого существа, подвергающегося низкотемпературному замораживанию. Вода, из которой на три четверти состоит любой человек, таит в себе две опасности, коварно проявляющиеся при замораживании. Первая — объемное расширение. Кто не и и дел бутылку с водой, лопнувшую на морозе, или искореженные трубы парового отопления, в которых замерзла вода. Против такой опасности клетки могли бы еще бороться — ведь их поверхностные пленки (мембраны) достаточно эластичны. По-настоящему страшна вторая опасность — кристаллы! Они образуются при замораживании воды. Именно кристаллы рвут и режут, как скальпелем, тело клеток — разрывают мембраны, разрушают пузырьки-вакуоли. После отогревания такая клетка уже не жилец.
Неудивительно поэтому, что подвергающаяся медленному охлаждению клетка стремится изо всех своих клеточных сил от этой ставшей коварной воды избавиться. Уже одноклеточные существа (например, амебы), боровшиеся с тяготами земной жизни задолго до появления первых многоклеточных научились при охлаждении, да и при прочих неблагоприятных для жизни условиях, активно избавляться от лишней воды — дегидратировать себя (греч. hydor — вода). Многие амебы, жгутиконосцы и инфузории способны образовывать окруженные многослойными стенками цисты покоя. В таких капсулах они переносят вмораживание в лед и хранятся там годами, не теряя жизнеспособности. На первых этапах образования такой цисты из клеток активно откачивается вода! Обезвоженной клетке уже ничего не страшно. Она может смело замерзать.
Клеткам высших теплокровных животных в жизни редко грозит переохлаждение. Тем не менее, они сохранили способность к дегидратации при охлаждении. Этот своеобразный «рудиментарный» процесс облегчает работу криобиологов и криоконсерваторов. Но если бы острые кристаллы льда были единственной опасностью, грозящей клеткам при замораживании! Кристаллизация воды внутри и вне клеток вызывает также дегидратацию (обезвоживание) макромолекул. Нередко при этом они переходят из растворимого состояния в нерастворимое. Другими словами выпадают в осадок. При замораживании происходит и множество других неприятных событий — например, изменяется концентрация солей. В ответ многие белки раскручиваются, денатурируют. Похожий процесс идет при варке яиц. Сваренный вкрутую белок уже никакими силами не сделаешь снова жидким, растворимым в воде. Следовательно, жизнь из такого яйца улетучилась навсегда.
Подвести краткий итог этим рассуждениям можно одной фразой. Замораживание — серьезнейшее испытание клетки на прочность.
Ледяные протекторы
Природа часто демонстрирует нам оригинальность и мудрость решений собственных задач и проблем. Исследователю остается лишь обнаружить путь, уже проторенный в течение миллионов лет эволюции. Так случилось и с криопротекторами — веществами, защищающими организм от неблагоприятных последствий при охлаждении. Люди давно замечали, что некоторые холоднокровные существа способны без особого для себя вреда буквально вмерзать в лед. За примерами не надо далеко ходить — кто не слышал о «стеклянных» лягушках, выкопанных зимой из смерзшегося ила. Другой, менее известный пример — земноводные сибирские углозубы, впаянные в линзы льда вечной мерзлоты. Без особого вреда переносят ледяной плен многие низшие ракообразные. Все эти очень опасные для теплокровных трюки их холоднокровные собратья проделывают за счет накопленных у них в крови специальных веществ-криопротекторов. К ним относится глицерин, различные сахара.
Уже упоминавшиеся лягушки перед зимовкой резко увеличивают количество глюкозы в крови, превращаясь на время как бы в диабетиков. В результате их кровь хотя и охлаждается ниже нуля, но не замерзает. Подобный опыт можно легко проделать самостоятельно — поставьте в морозильную камеру холодильника два стакана. Один с обычной водой, а в другой добавьте пять-шесть ложек сахара и размешайте. В каком стакане вода замерзнет раньше? Криопротекторы хорошо известны и автомобилистам. Чтоб жидкость в радиаторе машины не замерзала, в нее добавляют специальные вещества.
Итак, добавляя к клеткам обычную глюкозу или глицерин, можно обезопасить их от действия коварных ледяных кристаллов, образующихся в воде при замораживании. В криобиологии применяются и другие вещества, способные обезопасить клетки от повреждений — диметилсульфоксид, лактоза, метанол и другие. К сожалению, подбирая тот или иной криопротектор, ученым часто приходится работать «на ощупь» — в этой области науки еще много неясного.
Холод холоду рознь. Клетка — коллоидная система. Ее содержимое похоже на густой клейстер. Для того чтобы ее хорошенько заморозить, нужны очень низкие температуры — ниже -150 °C. Самые мощные холодильники такой холод обеспечить не в состоянии. Успех криоконсервации обязан технологии получения сжиженных газов. Жидкий азот, кипящий при -196 °C — вот основа любого криокомплекса. Другие криогенные жидкости либо пожароопасны, либо легко взрываются. Сжиженные же инертные газы (гелий, например) пока стоят дороже золота. Промышленное же производство одного литра жидкого азота стоит очень дешево.
Сверхнизкие температуры не только мгновенно останавливают протекание всех биологических процессов в клетках, они также позволяют уберечь клетки от уже упоминавшихся коварных кристаллов льда. Очень быстро помещая клетки в жидкий азот, буквально «выстреливая» в него микрокаплями жидкости с находящимися внутри клетками, можно добиться сверхбыстрого замораживания. Скорость падения температуры достигает при этом фантастической цифры — 500–1000 градусов в секунду! При такой скорости заморозки кристаллы льда просто не успевают образоваться! Наступает так называемое «стеклование» — образование своеобразного аморфного состояния замороженной цитоплазмы. В таком состоянии замороженные клетки можно хранить годами.
За все надо платить
В США, например, замораживание клеток человека давно поставлено на поток. Обычно криоцентры действуют при крупных университетах и исследовательских институтах. Существуют и частные компании, которые предлагают свои услуги всем желающим. Заморозка одной ампулы с клетками обходится клиенту примерно в 200 долларов. Количество криоцентров и интенсивность их работы в нашей стране не так уж малы, как можно себе представить. В Москве существует банк растительных клеток и банк половых продуктов сельскохозяйственных животных. В Пущино — банк микроорганизмов. В Петербурге в институте цитологии РАН существует криокомплекс, где хранятся десятки клеточных линий и несколько сотен так называемых гибридом — производителей высокоспецифичных антител. Не вызывает сомнения, что в будущем число подобных центров будет только расти.
Криобиологическая деятельностью рубежом достаточно обширна. Во Франции, например, работает институт холода, где регулярно проводятся интернациональные международные конференции. Активно работает международная ассоциация криобиологов. Не счесть чисто прикладные организации, специализирующиеся на длительном хранении клеток и тканей. Дело это экономически выгодное. Однако для успешного развития подобной деятельности в нашей стране одного вложения денег явно недостаточно. Необходимо еще разработать специальные законы, объясняющие права и обязанности сторон. Представьте себе, что вы отдали на хранение свои собственные клетки, а они погибли. Кто возместит ваши потери, в каком объеме? Как это сделать? На все эти непростые вопросы необходимо искать ответы.
