к стерильным, но не обеспечивает никакой защиты. Лучшим вариантом была бы крышка с просверлённым в ней отверстием диаметром 9-12 мм, прикрытым фильтром (лучше с отверстием побольше, заткнутым ватной пробкой —
прим. ред.). Лично авторы находят использование 2 л банок идеальным вариантом. (Заметьте, что такие банки следует инокулировать путём переноса зерна из мастер-банки — техника, которая будет объяснена ниже в данной главе). Использование фильтра на весь размер крышки у банок с широким горлом не рекомендуется, в связи с повышенным уровнем испарения влаги из зерна.
Чтобы получить зерно с влажностью 48–52 % используйте смеси, приведённые ниже, и автоклавируйте в скороварке 1 час при давлении 1,05 атмосферы (15–18 psi). Примите во внимание, что столовые мерные чашки не достаточно точны и ошибка может достигать 10 % от объёма. Проверьте вашу мерную чашку специальным градуированным цилиндром. Выяснив точность, используйте мерную чашку для зерна и мерную чашку для воды для соблюдения пропорций приведённых ниже:
СМЕСИ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЗЕРНА
ДЛЯ ЛИТРОВЫХ БАНОК
1 чашка ржи 2/3 — 3/4 чашки воды (или приблизительно)
240 мл ржи 170–200 мл воды
ДЛЯ 2-Х ЛИТРОВЫХ БАНОК
3 чашки ржи 1 и 3/4 чашки воды (или приблизительно)
600 мл ржи 400–460 мл воды
Данные смеси позволяют добиться заполнения банки на 2/3 после автоклавирования. В качестве добавки к этим формулам можно использовать мел/известь (СаСО3) и гипс (CaSО4) в пропорции 1–3 части по весу к 100 частям зерна (сухой вес). Соотношение мела и гипса 1:4. Добавление этих ингредиентов в субстрат опционально для большинства видов, но необходимо при выращивании Agaricus brunnescens. В варианте с использованием известкового буфера к формулам стоит добавить ещё 10 % воды.
После того как заполненные по формуле банки были автоклавированны, их следует перенести в стерильную комнату и остудить до комнатной температуры.
До момента внесения банок в стерильную комнату окружающий воздух следует обеззараживать используя стандартные методы дезинфекции или НЕРА-фильтры (или и то и другое).
Вынув банку из скороварки или автоклава её следует перетряхнуть для того чтобы разрыхлить зерно и перемешать сухие и влажные зёрна. Перетряхивание также позволяет избежать слипания зерна на дне банки.
Превосходным инструментом упрощающим процедуру перетряхивания может послужить лысая автопокрышка или обитый стул. Тщательно очищенная и продезинфицированная шина должна быть установлена в вертикальное и устойчивое положение. Поверхность покрышки идеально подходит для соударения при перетряхивании, уменьшает дискомфорт для рук и позволяет избежать травм, если банка разобьётся. Шина будет использоваться и на других стадиях развития зерновой культуры, так что мойте её регулярно. В тех же целях промышленные производители зерновой грибницы используют мешалки для краски, но это неприемлемо в домашних условиях.
ВНИМАНИЕ: ВСЕГДА ПРОВЕРЯЙТЕ БАНКИ НА ПРЕДМЕТ НАЛИЧИЯ ДЕФЕКТОВ ПЕРЕД ПЕРЕТРЯХИВАНИЕМ.
Когда банки достигли комнатной температуры можно начинать инокуляцию зерна мицелием с агара. Ещё раз: очень важно соблюдение хорошей гигиены. При переносе мицелия с агара на зерно добавляется ещё одно измерение в котором могут распространятся контаминанты. На агаре мицелий захватывает двухмерную плоскую поверхность и легко заметить заражение, если оно присутствует. На зерне в игру вступает добавляемое измерение глубины и контаминанты становятся более неуловимыми, часто ускользающими от распознания даже внимательным и проницательным глазом. Не будучи замеченными, контаминанты получают возможность распространится, когда данной грибницей будет инокулировано новое стерильное зерно.
Перед проведением пересадки примите все предосторожности и убедитесь в стерильности окружающей среды, в которой проводится инокуляция. После чистки комнаты не рискуйте её чистотой, входя в неё в грязной одежде. К сожалению лишь немногие культиваторы принимают во внимание тот факт, что они сами являются главным источником инфекции. На самом деле само человеческое тело суть среда, кишащая бактериями и микроскопическими клещами, усеянная спорами плесеней и семенами растений.
Только убедившись, что соблюдены все условия чистоты, можно приступать к производству грибницы.
Инокуляция стерильного зерна культурой на агаре
Выберите чашку с наиболее интенсивно растущей культурой, чей мицелий покрывает не более 3/4 поверхности агара. Следует избегать культур, которые полностью захватили поверхность чашки Петри, т. к. чаще всего контаминанты проникают в зазор между половинками чашки. Если внешние края заросли мицелием, эти захватчики могут проникнуть незамеченными. Так как периферийный мицелий засорён спорами контаминантов, любое зерно инокулированное им будет испорчено.
Простерилизовав скальпель в пламени горелки вырежьте треугольный ломтик агара покрытый мицелием, так как это описано в технике пересадки с агара на агар. Осторожно, отточенным и быстрым движением перенесите ломтик в ожидающую банку с зерном, как можно меньше держа её открытой. Прокаливая скальпель перед каждой пересадкой, инокулируйте ломтиком мицелия сколько вам угодно банок. Чашки Петри на две трети покрытой мицелием, должно хватить на 6–8 литровых банок с зерном (максимально возможное количество: 10–12 банок). Чем больше пересажено мицелия, тем быстрее колонизация и меньше шансы заражения.
С этого момента банки содержат в себе «мастер-культуру» и вы должны сделать всё возможное, чтобы гарантировать высочайший уровень её чистоты.
Авторы рекомендуют использовать технику «двойного ломтика», в которой исходный треугольник разрезается ещё на две части, и будучи насаженными на скальпель переносятся в ожидающую банку со стерильным зерном. Банки инокулированные данным методом зарастают гораздо быстрее, нежели при переносе целого ломтика.
Ослабление крышки банки перед инокуляцией облегчает быструю пересадку. По мере завершения каждого переноса с агара на зерно, закрывайте крышку и переходите к следующей инокуляции. Обработав таким образом всю партию, плотно заверните крышки и тщательно встряхните каждую банку для равномерности распределения ломтиков с мицелием. В ходе тряски ломтики перемещаются через массу крупы оставляя везде фрагменты мицелия прилипающие к зёрнам. Если ломтик прилипнет к стеклу, распределение затруднится и распространение мицелия задержится. Данная проблема указывает на то, что агар был налит в чашки слишком тонким слоем или пересушен. Встряхнув, инкубируйте грибницу в банках при температуре свойственной виду (повторное перетряхивание может потребоваться на 4-й или 5-й день). Чаще всего мицелий должен полностью колонизировать банки за 7-10 дней.
Прим. ред.: Техника показанная на снимках, подходит для работы в стерильном микробиологическом боксе или ламинаре, но совершенно не годится, когда нет такого оборудования. Причины:
1. путь движений с мицелием слишком длинен, обязательно попадут какие-нибудь микроорганизмы.
2. Нет ничего, убивающего все падающие споры и микроорганизмы.
Хорошая идея заключается в том, чтобы поставить горящий спиртовый факел, пространство над ним, и до некоторой степени вокруг, стерильно. Горячий воздух поднимается
