В последние годы промелькнуло обнадеживающее сообщение, что прионы накапливаются, помимо прочего, и в лимфоидных органах (в том числе и в миндалинах) и там их можно обнаружить [8, 14, 26]. В Англии начали анализировать удаленные у пациентов миндалины, которые там почему-то не уничтожают, а замораживают [14]. Однако есть экспериментальное исследование, в котором продемонстрировано, что при энцефалопатии кошек прионной этиологии иммуногистохимические методы не показали наличия прионов в лимфоидных органах [17]. По-видимому необходимы дальнейшие работы в данном направлении.
5.2. Методы посмертной диагностики
5.2.1. Гистология
Основана на детекции изменений, наиболее характерным из которых является вакуолизация серого вещества и цитоплазмы нейронов [13]. Характерен специфический «губчатый» вид срезов головного мозга [14, 15].
5.2.2. Биопроба
Прионы характеризуются малой видоспецифичностью. Показана возможность заражения ГЭ КРС овец, коз, свиней, мышей, морских свинок и домашней птицы. Можно заразить прионами человека или хомячка мышей [16, 13, 19]. Можно — человеческими прионами шимпанзе [8, 22] и т. д. [13]. Исходя из этого разработана следующая тест-система: экстракт головного мозга инъецируют лабораторным животным (мышам и хомячкам), наблюдая за результатом. Если животные заболевают, следовательно, проба положительна. Однако инкубационный период у мышей довольно длителен — месяцы [14], что, конечно, ограничивает применение данной тест-системы. В последние годы разрабатываются методики, позволяющие наиболее успешно инфицировать лабораторных животных. Так, оказалось, что введение хомячкам тестируемых проб прямо в язык заражает их в 1000 раз более эффективно, чем введение в другие части ротовой полости (при поедании зараженного материала прионы поступают через определенные нервные окончания во рту в мозг). И инкубационный период снижается до 1–2 недель [23]. И все-таки биопробы для тестирования мяса сейчас используются, по-видимому, редко.
5.2.3. Иммунохимические методы
Типы антител. Иммунохимические методы основаны на реакции биологического материала с антителами, специфичными к прионам.
Во-первых, используют антитела, которые реагируют с любыми прионами (как с нормальными, так и с патогенными). Как тогда различить нормальные и аномальные белки? Поскольку патогенный прион чрезвычайно устойчив к жестким воздействиям, то пробы предварительно подвергают им. Например, их обрабатывают протеазами, после чего нормальные белки расщепляются, а устойчивые аномальные формы — нет. И, как можно догадаться, если обнаружена положительная реакция с антителами, то она будет обусловлена именно патогенными прионами [14].
Во-вторых, получены и более специфичные как поли- [8], так и моноклональные антитела [8, 14], которые связываются только с белком, имеющим патогенную конформацию. Реакция с такими антителами указывает на наличие измененных прионов даже без предварительного устранения нормальных форм этих белков.
На наш взгляд, первый подход более корректен по двум причинам. Первая заключается в том, что даже полученные искусственно чистые антитела дают неспецифическую реакцию как с нормальными прионами, которые могут присутствовать в гораздо бóльших количествах, чем патогенные, так и с другими белками (хотя и в малой степени). Это обычное явление для антител; чтобы избежать его, необходимо использование дополнительных методических подходов. И все равно, поскольку результат очень важен, вряд ли можно добиться для массы проб полного отсутствия неспецифических реакций. Расщепление же протеазами всех белков, кроме патогенных прионов (первый подход), конечно, устранит данную проблему.
Вторая причина связана с гораздо большей стоимостью полученных на клеточных культурах искусственных антител по сравнению с антисывороткой, вырабатываемой организмом. В полупопулярных источниках из Сети указано, что, де, одна иммунологическая проба мяса на прионы стоит 7 тысяч долларов [27]. Откуда взята данная сумма, непонятно: за нее можно не только накупить антител на много проб, но и приобрести, думаю, почти все соответствующее оборудование. Разве что на холодильник глубокого холода не хватит. На мой взгляд, стоимость одного анализа завышена минимум раз в триста (считая зарплату начальникам). Тем не менее следует понимать, что указанные иммунохимические тесты, которые аналогичны тестам на ВИЧ, все же достаточно дороги. Они даже дороже, чем анализ на ВИЧ: по крайней мере, там нужно отбирать только кровь, а здесь надо готовить экстракты или срезы мозга [15].
Иммуноферментный анализ (ELISA). Это обычный ныне иммунохимический метод, который принят европейскими органами санитарного контроля мяса [15]. В его тонкости вдаваться не станем, скажем только, что реакция с антителами идет как бы в растворе, а пробы инкубируют в специальных пластиковых плашках (на много-много проб: как соты). Используются экстракты мозга (головного и спинного). Также определяют и ВИЧ-инфицирование (только антитела другие).
Иммуноблоттинг. Здесь реакцию с антителами проводят после фиксации белков на специальных мембранах [19, 28]. Этот метод более используется при экспериментальных исследованиях, чем при скриннинговых обследованиях десятков и сотен проб от туш забитых коров.
Иммуногистохимические методы. Срезы мозга обрабатывают специфическими к патогенному приону антителами в особых условиях, что обеспечивает характерное окрашивание (иной раз — флуоресценцию), обусловленное связыванием антител с детектируемыми в ткани белками [19, 28]. Вероятно, некоторые фирмы начали выпускать наборы реактивов, предназначенных именно для этого. Так, упоминается фирма “Prionics” [15].
Независимо от представленных выше иммунохимических методов, во всех случаях анализируют либо головной, либо спинной мозг, поскольку в остальных тканях прионы детектируются слабо. Исходя из этого становится весьма проблематичным упомянутое разрекламированное определение их в миндалинах.
5.3. Проверка на инфицированность прионами туш животных в России
Перечисленные иммунохимические методы (в особенности, ELISA) в настоящее время являются достаточно рутинными процедурами. Закупи необходимое оборудование (его не так много), закупи антитела, плашки и пипетки-дозаторы, да начинай. Правда, все указанное импортного производства. Отечественные пипетки не годятся, да и стоят почти столько же; специального спектрофотометра же, насколько мне известно, в России не выпускают (впрочем, сейчас в ней вообще ничего кроме пива и «Газелей», чтобы это пиво развозить, не выпускают). Практически все аналогично тест-лабораториям на ВИЧ. Экспресс-анализ мозга забитого животного занимает всего десять часов, а окончательный анализ срезов мозга — шестнадцать часов. То есть ровно столько, сколько необходимо для разделывания туши и заморозки мяса [19].
