Главная цель Уолли в 1965 году состояла в том, чтобы выделить лактозный репрессор. Поскольку в каждой бактериальной клетке было, судя по всему, лишь несколько молекул этого вещества, эта задача была не для малодушных. Двумя годами раньше Уолли провел несколько месяцев в безуспешных поисках лактозного репрессора, исходя из того, что он должен специфически связываться с веществами-индукторами, стимулирующими синтез β-галактозидазы. Почувствовав, что ничего не получается, он переключился на совместные эксперименты с Джулианом Дэвисом и Луиджи Горини, позволившие показать, что стрептомицин вызывает ошибки считывания генетического кода, чем, возможно, и объяснялось губительное воздействие этого сильного антибиотика на бактерии.
Найти лактозный репрессор стремился также немецкий биохимик Бенно Мюллер-Хилл, который был на год младше Уолли. Бенно вырос в семье с либеральными политическими взглядами и «полевел», когда был студентом-химиком и попал в среду немецких студентов-социалистов, открыв для себя, что многие из преподавателей Мюнхенского университета были некогда сторонниками нацистов, причем никого из руководства это, казалось, не беспокоило. Впоследствии Бенно работал над диссертацией в своем родном городе Фрайбурге в лаборатории специалиста по углеводам Курта Валленфельса. Там он освоил основы химии белка, изучая β-галактозидазу. Впоследствии, осенью 1963 года, Бенно получил ставку постдока в лаборатории Говарда Рикенберга в Индианском университете, куда он привез из лаборатории Валленфельса образцы гликозидов, чтобы изучать их способность специфически индуцировать синтез β-галактозидазы.
В Блумингтоне Бенно никогда не чувствовал себя уютно — ни как немец среди многочисленных работавших там биохимиков-евреев, ни как левый среди американцев, удивлявших его своими параноидальными идеями о коммунистах в их среде. Но проведенные там эксперименты, результаты которых дали ему достаточно материала для доклада на Международном биохимическом конгрессе в Нью-Йорке в августе 1964 года, вполне вознаградили его за эти трудности с общением. К тому времени он хотел обратиться к изучению лактозного репрессора и подошел ко мне после моего доклада, чтобы узнать, не возьму ли я его в свою гарвардскую лабораторию. Объяснив, что ему нужно обратиться не ко мне, а к Гилберту, я убедил его посетить Гарвард, как только Уолли вернется из своей продолжительной поездки в Англию. Когда они встретились, Уолли сразу увидел в Бенно как раз того сотрудника, что был ему нужен, и предложил ему исследовательскую ставку, которую тот мог получить, как только, не нарушая приличий, покинет лабораторию Говарда Рикенберга.
В Блумингтоне Бенно научился генетическим манипуляциям с Е. coli. Вскоре после прихода в Гарвард он умело применил эти недавно приобретенные навыки, чтобы показать, что лактозный репрессор действительно представляет собой белок, а не молекулу РНК. Используя химические мутагены, он получил почти двести мутантов Е. coli, синтезировавших β-галактозидазу в отсутствие каких бы то ни было индукторов. У двух из этих двухсот мутация представляла собой изменение исходного кодона на "нонсенс-кодон", что приводило к преждевременной терминации синтеза полипептидной цепочки. Если бы репрессор представлял собой РНК, такого класса мутантов не должно было существовать. Первый черновой вариант рукописи Бенно не открывал всей простоты и изящества поставленного им эксперимента. Сказав ему, что его рукопись написана в тяжелом тевтонском стиле, я переписал ее, и в октябре она была отдана в Journal of Molecular Biology. Как один из редакторов этого журнала, я знал, что она будет быстро опубликована.
Хотя и Бенно, и Уолли в своих предшествующих независимых исследованиях не смогли выделить лак-репрессор через его связывание с сильными индукторами β-галактозидазы, по-прежнему единственный подход у них в распоряжении был основан на этом свойстве peripeccopa. Чтобы увеличить шансы на успех, Бенно вновь обратился к генетике бактерий, получив мутантный репрессор, обладавший повышенным сродством к веществу-индуктору изопропил-(3-0-1-тиогалак-топиранозиду (ИПТГ). Выращивая мутантные клетки Е. coli при очень низких концентрациях ИПТГ, можно было получить намного более эффективный репрессор. Чтобы удвоить количество репрессора в бактериях, Бенно получил из исходного мутанта нового, диплоидного, содержавшего соответствующий ген в двух экземплярах. Однако сами по себе эти генетические уловки еще не позволяли засечь лак-репрессор в бесклеточном экстракте. Успех пришел только благодаря разработке методики разделения веществ, которая давала образцы белков, богатые лак-репрессором. Первые положительные результаты были получены в мае 1966 года, но они были весьма ненадежны. В бактериальных экстрактах, содержащих репрессор, оказывалось лишь на 4% больше помеченного радиоактивной меткой ИПТГ, чем в окружающем, лишенном репрессора растворе. Вскоре более совершенные методы фракционирования позволили получить частично очищенный образец, собиравший ИПТГ в полупроницаемом диализном мешке в концентрации, почти вдвое превышавшей ту, что наблюдалась снаружи. На эти обогащенные экстракты не действовали ферменты, расщепляющие ДНК и РНК. Ферменты протеиназы, расщепляющие белок, напротив, полностью останавливали связывание ИПТГ, подтверждая вывод генетических исследований Бенно, что репрессор представляет собой белок.
До этого у Уолли и Бенно была вполне реальная перспектива оказаться не первыми, кто опишет молекулярную природу одного из репрессоров. На пятом этаже работал двадцатишестилетний Марк Пташне, который лихорадочно пытался выделить репрессор фага λ. Когда фаг пребывает в виде неактивного профага на хромосоме Е. coli, этот репрессор блокирует работу всех генов фага λ, кроме одного. Единственный ген фага λ, который при этом работает, есть ген, кодирующий сам репрессор. Хотя о его существовании стало известно благодаря изящным генетическим экспериментам, постаатенным в Институте Пастера, никто в Париже не смог предложить какого-либо реального подхода для выяснения его молекулярных свойств.
Марк пришел в Гарвард осенью 1960 года, чтобы работать над диссертацией доктора философии под руководством Мэтта Мезельсона. Такими же неотъемлемыми составляющими его натуры, как стремление заниматься передовыми научными исследованиями, были его кожаная мотоциклетная куртка, скрипка и клюшки для гольфа. Когда Марк учился в средней школе, он проводил летние каникулы в Миннесотском университете, где работал в лаборатории нейрофизиологии, которой руководил друг его семьи, человек левых убеждений. Он предпочел Гарварду Рид-колледж, где большое внимание уделялось проблемам образования, перешел с философии на биологию, а в течение лета перед последним годом в колледже работал в Орегонском университете. Там Фрэнк Сталь посоветовал ему пойти учиться дальше в Гарвард, чтобы работать под руководством Мэтта Мезельсона. Марк уже знал, что следующей большой задачей в мире изучения бактериофагов было выделение репрессора фага λ. Но эта цель была слишком рискованной для ранней диссертации доктора философии, поэтому Марк взялся за довольно рутинный генетический анализ фага λ. Когда его экспериментальная работа по теме диссертации подходила к концу, Пол Доути и я приложили все усилия, чтобы Марка взяли на три года в Гарвардское общество стипендиатов. Это дало бы ему шанс разобраться с репрессором фага λ. Его кандидатура прошла на ура, поскольку Василий Леонтьев, новый глава Общества стипендиатов, видел в Марке подходящего человека для участия в разговорах за ужинами общества по понедельникам. Он стал младшим стипендиатом в июле 1965 года. В августе того же года я подал в Национальный научный фонд заявку на грант в размере 55 000 долларов, чтобы из этих денег выплачивать Марку зарплату и оплачивать расходы на его лабораторные исследования в течение трех лет, в том числе зарплату лаборанту в размере 5000 в год. Это финансирование позволило бы ему работать независимо от его руководителя, Мэтта Мезельсона, который к тому времени совершенно отчаялся от стиля работы Марка, нередко небрежного. При этом в моей заявке отмечалось, что Марк будет использовать для выявления репрессора фага λ технологию ДНК-РНК-гибридизации, которая начала давать сумбурные результаты еще до того, как грант был получен. О том, как РНК-полимераза считывает гены в бесклеточных экстрактах, известно было недостаточно.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
