Реакцию кольцепреципитации широко используют не только в диагностике инфекционных болезней бактериальной природы, но и в судебной медицине – для определения видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен; в санитарной практике – при выявлении фальсификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. С ее помощью удается определить степень родства различных видов животных и растений.
Реакция преципитации Оухтерлони. Так как реакцию Оухтерлони ставят на чашках Петри в лунках пластинчатого агара, то ее также называют реакцией преципитации в агаровом геле (РПГ). При этом исследуемые и известные антигены вносятся в одни противостоящие лунки, а иммунные и нормальные сыворотки – в другие, после чего РПГ помещают на 24-48-72 ч в термостат. Диффундируя в агар навстречу друг другу, антитела и антигены при положительной реакции образуют иммунные комплексы, визуально обнаруживаемые в виде белых полос между лунками (рис. 6, б). В различных модификациях реакция
Оухтерлони используется в диагностике вирусных и бактериальных заболеваний.
Реакция гемолиза
При постановке реакции гемолиза используют бараньи эритроциты, гемолитическую сыворотку, содержащую специфические к ним гемолизины, и комплемент. Протекает она в две фазы: в первой – эритроциты взаимодействуют с гемолизинами сыворотки, во второй – сенсибилизированные лизинами эритроциты растворяются под действием комплемента.
Гемолиз происходит при наличии строго определенного соотношения используемых в реакции ингредиентов (табл. 1).
Бараньи эритроциты для реакции гемолиза получают в день ее постановки. Кровь дефибринируют во флаконе со стеклянными бусами, далее готовят 3 %-ную взвесь, отмывая эритроциты изотоническим раствором натрия хлорида при центрифугировании.
Гемолитическую сыворотку готовят в производственных институтах, вводя кроликам парентерально 3–4 раза по 2–5 мл 50 %-ной взвеси бараньих эритроцитов. Для реакции гемолиза пригодна сыворотка с титром не ниже 1:1200, но в опыт берется в тройном титре, т. е., если титр гемолитической сыворотки равен 1:1200, то используют титр 1:400.
Таблица 1.
Схема постановки реакции гемолиза
Титром гемолитической сыворотки называют ее максимальное разведение, которое в присутствии комплемента при 37 °C вызывает полный гемолиз бараньих эритроцитов в течение 1 ч.
В качестве комплемента применяют сыворотку крови морских свинок, точнее, производственный сухой комплемент, который при правильном хранении не теряет своей активности 1–2 года.
Учет реакции производят через 1 ч после инкубации пробирок в термостате при температуре 37 °C.
Реакцию гемолиза используют для определения количества комплемента в сыворотке крови людей, но чаще – как индикатор в реакции связывания комплемента.
Реакция связывания комплемента
Реакция связывания комплемента (РСК). Сложная двухэтапная реакция, в которой используются пять ингредиентов, составляющих две системы: антиген, антитело и комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащие специфические к ним антитела (вторая, или гемолитическая индикаторная система).
Взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, что сопровождается активацией (адсорбцией) на нем комплемента, но визуально обнаружить это невозможно. Ввиду чего Дж. Борде и О. Жангу предложили на втором этапе постановки реакции в качестве индикатора фиксации комплемента на комплексе антиген – антитело использовать гемсистему, которая, являясь иммунным комплексом, тоже способна связывать его.
В конечном итоге возможны два результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу, а комплемент связывается образовавшимся комплексом, гемолиза эритроцитов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену комплемент, оставаясь свободным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз (рис. 7).
Как и другие серологические реакции, РСК может быть использована для выявления специфических антител по известному антигену или для определения антигена по известным антителам.
Накануне постановки РСК исследуемая сыворотка прогревается на водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин для инактивации в ней собственного комплемента, а затем разводится, начиная с 1:5.
Рис. 7. Реакция связывания комплемента: I – положительная; II, III – отрицательные; Ат – антитело; Аг – антиген; К – комплемент; Эр – эритроциты барана
Антигеном для РСК могут быть культуры убитых бактерий, их лизаты, экстракты из патологически измененных и нормальных органов, тканевые липиды, вирусы и вируссодержащие материалы. Сухой комплемент или свежая сыворотка морской свинки перед титрованием разводится 1:10. Гемсистема, или смесь равных объемов гемолитической сыворотки в тройном титре и 3 %-ной взвеси бараньих эритроцитов по осадку, для сенсибилизации эритроцитов выдерживается в термостате при температуре 37 °C в течение 30 мин.
Перед постановкой РСК комплемент и антиген титруются. Необходимость в титровании комплемента диктуется тем, что его содержание в крови морских свинок непостоянно. Для этого основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и в каждую из них прибавляют 0,85 %-ный раствор натрия хлорида, доводя объем до 1,5 мл. Пробирки ставят в термостат при температуре 37 °C на 45 мин, после чего к ним добавляют гемсистему и вновь инкубируют в термостате 30 мин. Затем определяют титр комплемента – наименьшее его количество, вызывающее гемолиз (табл. 2).
Если, например, он будет составлять 0,25 мл, то в РСК вводят рабочую дозу комплемента, которая на 20–30 % выше титра, т. е. используют следующую дозу (0,3 мл), вызвавшую полный лизис эритроцитов, доводя ее до 0,5 мл изотоническим раствором натрия хлорида.
Таблица 2.
Схема титрования комплемента
Необходимость в титровании антигена, используемого в РСК, связана с тем, что он может адсорбировать некоторое количество комплемента, т. е. обладать антикомплементарными свойствами. Для определения титра антигена его разливают в ряд пробирок в уменьшающихся дозах от 0,5 до 0,05 мл и добавляют 0,85 %-ный раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1 мл. Затем в каждую пробирку доливают по 0,5 мл рабочей дозы комплемента и помещают их в термостат на 1 ч при температуре 37 °C. После этого во все пробирки добавляют по 1 мл гемсистемы, вновь инкубируют в термостате 1 ч и учитывают результаты (табл. 3).
Таблица 3.
Схема титрования антигена
Титром антигена считается его наименьшая доза, при которой наступает полный гемолиз. В РСК используют рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2-2/3 титра. Если титр комплемента в присутствии антигена снижается более чем на 30 %, то он непригоден для реакции.
Оттитровав комплемент и антиген, ставят основной опыт РСК (табл. 4).
Для этого берут три пробирки, в каждую из них вносят по 0,5 мл соответствующих ингредиентов.
На начальном этапе в первую (опытную) наливают все три компонента РСК – сыворотку, антиген, комплемент; во вторую – сыворотку, комплемент, а вместо антигена – изотонический раствор натрия хлорида (контроль сыворотки); в третью – антиген, комплемент, а вместо сыворотки – тот же раствор натрия хлорида (контроль антигена). Пробирки ставят в термостат при температуре 37 °C на 1 ч.
Таблица 4.
Схема постановки реакции связывания комплемента
На втором этапе реакции в каждую пробирку вносят гемсистему, и после перемешивания пробирки вновь помещают в термостат на то же время, а затем учитывают результаты РСК.
Интенсивность реакции отмечается плюсами: «++++» – полная задержка гемолиза, жидкость в пробирке бесцветна, все эритроциты оседают на дно (резко положительная РСК); «+++», «++» – слабый гемолиз, уменьшенное количество эритроцитов в осадке (положительные РСК); «+» – выраженный гемолиз, жидкость окрашена в розовый цвет, незначительное количество эритроцитов в осадке (слабоположительная РСК). Отрицательная РСК обозначается знаком «-». При этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет цвет алой, или «лаковой», крови.
Чувствительность РСК повышается, если связывание комплемента проводить на холоде при температуре 4 °C в течение 18–20 ч. В такой модификации РСК используется в диагностике вирусных инфекционных болезней. Антигены из высоковирулентных вирусов инактивируют добавлением слабых концентраций формалина (1:500-1:1000) или УФ-облучением.
