Натуральные среды состоят из белковых продуктов животного, растительного и микробного происхождения. Химический состав их непостоянен и может в значительной степени варьировать.
К простым натуральным питательным средам относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), молоко и овощи, например кусочки картофеля, свеклы, моркови.
Основой для приготовления МПБ и МПА служит мясная вода. Готовят ее следующим образом. Свежую говядину или телятину, отделенную от костей, жира и сухожилий (500 г), пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 л водопроводной воды, хорошо размешивают и оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 °C. Далее настой мясного фарша отжимают через марлю, кипятят в течение 5 мин для свертывания белков, пропускают через ватный фильтр, доливают до первоначального объема водой и после разлива в колбы и флаконы стерилизуют в автоклаве. Содержащая определенное количество аминокислот, витаминов группы В, солей, углеводов, факторов роста, прочих экстрактивных веществ мясная вода после автоклавирования должна иметь вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (pH 6,2–6,4).
Для приготовления МПБ к мясной воде прибавляют 1 % сухого пептона (смесь альбумоз, полипептидов и аминокислот), 0,5 % натрия хлорида и, устанавливая нужный уровень pH среды (для бактерий-нейтрофилов – 7,2–7,6, для алкалифилов -7,8–8,6, для ацидофилов – 4,0–6,0), кипятят 30 мин, фильтруют и стерилизуют в автоклаве.
МПА готовят на бульоне, прибавляя хорошо промытый агар-агар, который после расплавления и охлаждения придает среде плотную (1,5–3 %) или полужидкую (0,15-0,4 %) консистенцию студня (геля).
В настоящее время бактериологические лаборатории широко используют сухие питательные среды в виде порошков, хранящихся в герметично закрытых банках. Готовят эти среды по указанным на этикетках прописям. Навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллированной воды, среду разливают в соответствующую посуду и стерилизуют. Преимуществом сухих производственных сред является постоянство их состава, стандартность, удобство в приготовлении, легкость транспортировки.
Молоко как простая среда становится пригодным для выращивания бактерий лишь после снятия сливок, для чего требуется отстаивать его в холодильнике, а овощи – после очищения от кожуры и получения сочных ломтиков.
Сложные питательные среды готовят на основе МПБ или МПА, добавляя к ним углеводы, сыворотку, молоко, дефибринированную кровь животных и человека, асцитическую жидкость брюшной полости больных. Среди них выделяют специальные среды, которые по своему назначению делят на селективные (элективные) и дифференциально-диагностические.
Синтетические среды создаются из химически чистых соединений в строго определенных концентрациях в зависимости от потребностей микроорганизмов в факторах роста. Готовят их на основе минимальных сред.
Важным показателем пригодности среды является ее pH, которая для большинства патогенных микробов соответствует 7,2–7,4.
По температурному оптимуму роста бактерии подразделяют на психро- (15–20 °C), термо- (50–60 °C) и мезофилы (30–37 °C). Болезнетворные виды микробов в большинстве своем – мезофилы.
Вырастая на поверхности плотных питательных сред, отдельные особи микробов, а также протесты образуют колонии, представляющие собой однородную популяцию клеток. При этом у разных видов бактерий, грибов и микоплазм колонии неодинаковы по размерам, очертаниям, характеру поверхности, особенностям краев, прозрачности, влажности, консистенции, окраске и пр. При густом засеве плотная среда покрывается сплошным налетом культуры, который называют газоном.
Питательные среды готовят в эмалированной и стеклянной посуде. Новую стеклянную посуду для нейтрализации растворимой щелочи кипятят в 1–2 %-ном растворе соляной кислоты, а бывшую в употреблении – моют в мыльном или содовом растворе. Ту и другую прополаскивают, тщательно промывают в проточной воде и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки заливают питательными средами, закрывают ватными тампонами (пробками) и стерилизуют.
Способы посева патологических материалов и протистов
Существует несколько способов посева, но каждый из них может отличаться некоторыми техническими особенностями, зависящими от инструмента засева, консистенции питательной среды, посуды, в которой она находится, характера засеваемого вида протесты, материала, в котором он содержится. При этом засев производят бактериальной петлей или иглой, микробиологическим шпателем, градуированной пипеткой. К основным из них относятся посевы бактериальной петлей и шпателем.
Посев бактериальной петлей на скошенную и жидкую среды в пробирках. Приступая к засеву, в левой руке размещают две пробирки, например с чистой культурой бактерий и со стерильной средой, держа их в наклонном положении так, чтобы не проливалось имеющееся в них содержимое. В правую руку, как пишущую ручку, берут петлю и в вертикальном положении фламбируют в пламени горелки. Пробки из пробирок вынимают одновременно, зажав их между мизинцем и ладонью правой руки, тотчас же обжигают края горлышек пробирок. Прокаленную петлю вводят в пробирку, охлаждают, прикасаются к культуре и быстро переносят ее в пробирку со средой, ополаскивая петлю в бульоне или распределяя штрихами по скошенной поверхности агара. Петлю извлекают, фламбируют края пробирок и закрывают их проведенными через пламя пробками, затем петлю стерилизуют, пробирки надписывают и ставят в штатив.
Посев уколом в столбики полутвердых сред. Обычно засевают полутвердые столбики МПА и желатина, насквозь прокалывая их иглой или петлей, при этом пробирки держат дном вверх. Посев применяют для выращивания бактерий-анаэробов, хранения культур, выявления ферментативных свойств.
Посев пипетками. Пробирку (колбу), содержащую жидкую среду, держат левой рукой под небольшим углом, а градуированную пипетку с материалом под таким же наклоном, но в обратном положении – в правой. Переносят его в питательную среду после снятия пробки и фламбирования горлышка пробирки, погружая кончик пипетки до дна. Материал выдувают и тщательно перемешивают в среде. Пробирки закрывают, а пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.
Посевы на плотные среды в чашках Петри
Приготовленные впрок плотные питательные среды, например МПА, расплавляют и, остудив их до 50–60 °C, берут флакон в правую руку, а левой вынимают пробку, обжигая горлышко. Большим и указательным пальцами левой руки приподнимают крышку чашки Петри и, не касаясь ее краев, вводят под нее горлышко, выливая 15–20 мл среды. Быстро закрывают крышку и флакон. Чашку слегка покачивают для равномерного распределения среды и оставляют на столе для застывания. Затем переносят ее в термостат, переворачивают вверх дном, снимают крышку и в таком положении 15–20 мин подсушивают в термостате.
Посев бактериальной петлей. Исследуемый жидкий материал набирают петлей и, не прикасаясь к стенке пробирки, встряхивают для удаления излишка. Чашку Петри с агаризованной средой помещают на столе вверх дном. Донную часть чашки берут левой рукой и держат почти вертикально, петледержатель – большим и указательным пальцами правой руки; легкими движениями наносят оставшуюся часть материала параллельными штрихами по всему диаметру поверхности среды.
Посев шпателем. Шпатели готовят из стеклянных палочек толщиной 4–5 мм, согнутых в виде треугольника. Стерилизуют их завернутыми в бумагу в сухожаровом шкафу, а также сжиганием спирта после предварительного их смачивания. Засевают шпателем каплю материала или взвеси микробов, распределяя ее круговыми движениями по всей поверхности питательной среды и удерживая левой рукой крышку чашки Петри в приоткрытом положении. Одним шпателем тем же приемом засеваются поочередно вторая и третья чашки, после чего его погружают в банку с дезинфицирующим раствором. Чашки переворачивают, надписывают и ставят в термостат вверх дном, чтобы избежать размывания растущих колоний на среде капельками конденсационной воды, которые скапливаются на внутренней поверхности крышки при обычном ее положении.
Патологическими материалами, которые используются для посева на питательные среды, могут быть кровь, спинномозговая жидкость, пунктаты (от лат. punctum – прокалывать), например полостей и лимфоузлов (секреты), рвотные массы, промывные воды желудка, моча, испражнения, гной, слизь, мокрота (экскреты). Эти и другие материалы берутся стерильными инструментами и помещаются в стерильные банки, флаконы, пробирки и направляются на исследование.
В сопроводительном листе, прилагаемом к пробам, должны быть указаны фамилия, инициалы больного или умершего, материал, цель исследования, название направляющего пробы учреждения, адрес лаборатории, куда они доставляются, и дата.
