Метод обогащения почвы . Почву, из которой предполагают выделить антагонистов, обогащают организмами тех видов, по отношению к которым хотят получить антагонист. С этой целью к образцам почвы, помещенным в стеклянные сосуды, систематически добавляют отмытую суспензию нужных микроорганизмов. Затем через определенные промежутки времени такая почва высевается в виде отдельных комочков на агаровые пластинки в чашках Петри, предварительно засеянные тем же самым организмом, который использовался для обогащения почвы.
Метод центрифугирования почвенной суспензии . Для выделения актиномицетов из почв, особенно из почв в весеннее время, когда в ней развивается большое число грибов и бактерий, применяется метод центрифугирования почвенной взвеси. Метод основан на различии скорости оседания отдельных видов микроорганизмов в центробежном поле. При 3000 об/мин в течение 20 мин частицы, соответствующие по размерам спорам плесеней или клеткам бактерий типа В.mesentericus, В.mycoides, В.subtilis, осаждаются на дно пробирки. Частицы же, соответствующие по размерам спорам актиномицетов, оказываются при данной скорости центрифугирования в поверхностном слое жидкости.
Высевая надосадочную жидкость, удается в большинстве случаев (до 92 %) получить на пластинках агара только колонии актиномицетов.
Метод замораживания – оттаивания почвы . Известно, что микроорганизмы в почве находятся в адсорбированном на почвенных частицах состоянии. Для полноты десорбции микроорганизмов с почвенных частиц применяются различные методы: химические, при которых почвенные образцы обрабатывают различными детергентами, физические, в основе которых лежит метод механического растирания образцов почвы.
Для лучшей десорбции микроорганизмов с почвенных частиц рекомендуется использовать метод замораживания – оттаивания почвы. Данный метод позволяет обнаружить в них в 1,2-3,6 раза больше актиномицетов, чем в тех же образцах без замораживания. Это, по-видимому, связано с повышением десорбции актиномицетов с поверхности почвенных частиц.
Применение питательных сред, содержащих антибиотики . При высеве почвенной суспензии на агаровые пластинки создаются трудности для развития редко встречающихся видов актиномицетов в результате быстрого развития бактерий и широко распространенных в почвах видов актиномицетов. Поэтому для целей направленного выделения определенных групп микроорганизмов в среды для высева почвенной суспензии добавляют различные антибиотики. При добавлении антибиотиков к среде для культивирования микроорганизмов происходит подавление обычной микрофлоры, создаются условия для развития устойчивых к этим антибиотикам форм микробов; последние могут оказаться новыми или редкими видами, способными образовывать и новые антибиотики. Для этих целей часто используют антибактериальные и противогрибные препараты.
Для выделения актиномицетов применяют среды, содержащие в своем составе такие антибиотики, как тетрациклины, неомицин, нистатин, стрептомицин, хлорамфеникол, пенициллин и др. При выделении продуцентов новых антибиотических веществ используют среды, содержащие стрептомицин в концентрациях от 25 до 100 мкг/мл и рубомицин – от 5 до 20 мкг/мл.
В случае добавления к среде стрептомицина наблюдается значительное подавление роста наиболее часто встречающихся видов – Str.griseovariabilis, Str.flavochromogenes, Str.griseolis, Str.aureofaciens, Str.griseus и др. – и выделение культур актиномицетов, которые не обнаруживались на той же среде без стрептомицина. С повышением концентрации стрептомицина в среде общее количество выделяемых актиномицетов уменьшается, однако при этом происходит выделение новых культур актиномицетов.
Рубомицин внесенный в среду для высева почвенной суспензии в значительной степени подавляет рост культур актиномицетов. Довольно устойчивыми к этому антибиотику оказались представители секций Roseus, Helvolo-Flavus и Albus. В указанных условиях в значительном числе вырастают культуры актиномицетов, не образующие воздушный мицелий.
В последнее время показано, что продуценты, например, аминогликозидных антибиотиков, могут быть найдены, в основном, только среди стрептомицетов, устойчивых к действию этих антибиотиков.
Известны и другие методы выделения микробов-антагонистов из естественных мест их обитания. По мнению некоторых микробиологов, к настоящему времени выделено и изучено не более 10 % всех имеющихся в природе микроорганизмов. Поэтому необходимо изучать и разрабатывать новые приемы выделения микробов, которые бы способствовали максимальному обнаружению их в природе.
3.3 Методы идентификации микроорганизмов продуцентов антибиотических веществ
После того как микроорганизм, обладающий ценными антибиотическими свойствами, тем или иным способом выделен из субстрата, необходимо определить принадлежность этого организма к определенному виду. Следовательно, исследователи должны владеть методами идентификации микроорганизмовпродуцентов антибиотиков. Известно, что определение видовой принадлежности микроорганизмов задача нелегкая, требующая больших навыков и умения.
При определении вида микроорганизма-продуцента антибиотического вещества используется большой комплекс признаков. В первую очередь используются признаки, легко наблюдаемые при культивировании организмов визуально или с помощью микроскопа, такие как морфологические (форма колоний на твердых средах, форма и размеры клеток, спор и спороносцев, характер спорообразования, наличие жгутиков, капсул или слизи вокруг клеток и другие признаки) и культуральные (характер роста организма на различных средах, наличие или отсутствие окраски субстрата и самих клеток, развитие в аэробных или анаэробных условиях, температурный оптимум развития и т.д.) признаки.
Однако установлено, что морфологических и культуральных признаков микроорганизмов часто бывает недостаточно для определения вида микроорганизма. Тем более это трудно сделать в группах микробов, близко стоящих друг к другу в родовом отношении.
Поэтому наряду с морфологическими и культуральными признаками для идентификации выделенных микроорганизмов используют и другие признаки. К их числу относятся физиологические и биохимические особенности организмов.
Под физиологическими свойствами микроорганизмов необходимо иметь в виду биохимическую сущность и биологическое значение тех процессов, которые совершаются в культуре, а не простую констатацию явлений (например, разжижение желатины, пептонизация молока и т.п.), которые иногда обнаруживаются на случайно взятых и часто неизвестных по составу средах.
К биохимическим особенностям микроорганизма относятся характер и пути превращения компонентов субстрата с образованием типичных для данного вида продуктов обмена (кислот, спиртов, пигментов, витаминов, антибиотиков, аминокислот и др.), типичные реакции метаболизма, характеризующие биосинтетические процессы в клетке, последовательность оснований нуклеиновых кислот, специфичная для разных видов организмов, а также другие признаки.
В последнее время все чаще и чаще для определения видов используют серологические реакции, которые весьма специфичны и позволяют дифференцировать виды, близко стоящие друг к другу. Реакции агглютинации и преципитации находят применение для идентификации не только бактериальных организмов, но и актиномицетов.
Для дифференциации видов бактерий и актиномицетов с успехом используют бактериофаги и актинофаги. Для распознавания видов актиномицетов лучшими признаны актинофаги, выделенные из лизогенных культур актиномицетов. Обычно такие фаги оказываются более специфичными по характеру и спектру их действия.
Однако при использовании актинофагов для дифференцирования видов следует иметь в виду и те трудности, которые обнаруживаются при этом. Необходимо помнить, что среди актиномицетов нередко встречаются штаммы, устойчивые к фагам, а среди актинофагов имеются и полифаги, лизирующие клетки многих видов актиномицетов. Все это свидетельствует о том, что использование фагов для идентификации видов может иметь лишь вспомогательное значение, т.е. служить дополнительным признаком.
3.3.1 Идентификации видов актиномицетов-антагонистов
Определенное значение при идентификации видов актиномицетовантагонистов, принадлежащих к одной группе, имеет метод, основанный на специфическом действии микробов-антагонистов. Специфичность действия микробов-антагонистов состоит в том, что, например, продуценты стрептомицина, выделенные из различных районов земного шара, не подавляют развитие друг друга. Такая закономерность характерна и для других видов актиномицетов.
