то, что сообщил мне об этом подходе).
Подготовка «косяков» для проращивания спор.
Чтобы подготовить скошенный агар для спор, следуйте выше приведенной методике с небольшими изменениями. При приготовлении среды не добавляйте перекись.
1. Прогрейте подготовленную среду в скороварке в течение 10 минут.
2. Залейте расплавленную среду в пробирки.
3. Закройте пробирки пробками и стерилизуйте под давлением в скороварке.
4. Разместите пробирки с горячей средой наклонно для застывания и формирования скосов.
В качестве альтернативного метода, вы можете простерилизовать пробирки и среду раздельно, разлить среду по пробиркам в стерильных условиях.
Чтобы вырастить споры одной разновидности гриба, имеет смысл засеять 5–6 «косяков», возможна потеря пары «косяков» вследствие заражения. Часть «косяков» может не прорасти.
Получение спор.
Способы сбора спор:
1. Пропарьте несколько чашек Петри в скороварке под давлением в течение 15 мин. И охладите их[63].
2. Выберете зрелое плодовое тело гриба, с которого вы хотите получить споры. Гриб должен быть чистым, без загрязнения землей.
3. Выберете чистую поверхность, в закрытом помещении без сильных воздушных потоков. Протрите поверхность губкой, смоченной в спирте.
4. Откройте одну из чашек Петри (можете положить крышку на край чашки), положите грибное тело в чашку так, чтобы гриб не касался дня чашки (для маленьких плодовых тел, натяните нити и положите на них гриб).
5. В зависимости от разновидности гриба, процесс сбора спор может занять некоторое время. Сбор спор можно считать законченным, когда на дне чашки появится видимый налет спор. После этого удалите гриб и закройте чашку.
Проращивание спор.
Вот один из способов проращивания спор:
1. Настройте свет и поставьте горящую спиртовку на ровной чистой поверхности. Рядом поставьте пробирки со скошенным агаром и чашку со спорами.
2. Прожгите микробиологическую петлю в верхней части пламени спиртовки.
3. Откройте одну из пробирок (придерживайте пробку мизинцем другой руки). Горлышко пробирки должно быть в пламени спиртовки. Проведите петлей по поверхности агара, для лучшей прилепляемости спор к петле. Выньте петлю из пробирки и закройте ее.
4. Откройте чашку со спорами и проведите концом петли по покрытой спорами поверхности.
5. Откройте снова пробирку, держа ее горлышком в пламени спиртовки, и проведите кончиком петли по поверхности агара.
6. Выньте петлю и закройте пробирку пробкой.
7. Поместите пробирки с культурой в теплое место. Прорастать споры могут от нескольких дней до нескольких недель, в зависимости от вида гриба.
В конечном счете, вы увидеть рост маленьких белых колоний гриба на «косяках». Будет необходимо отличать колонии грибного мицелия от колоний других загрязнителей. Некоторые контаминанты в начале развития имеют белые колонии, похожие на колонии чистой культуры, но они довольно быстро приобретают синюю или зеленую окраску при спороношении[64]. Дикие дрожжи и бактерии могут образовывать лучистые колонии слегка окрашенные или бесцветные, однородные и не имеющие гифов, как грибные. Как только вы убедитесь, что выросшие колонии действительно принадлежат нужному грибу, пересаживайте гриб на перекисную среду.
При рассматривании роста мицелия на перекисном агаре в чашках Петри, вы можете увидеть кольца (ареолы) роста мицелия. Если мицелий не однороден или загрязнен, то ореол на чашке покажет наличие секторов с различной скоростью роста. В этом случае можно взять мицелий для пересадки с края сектора, имеющего хороший радиальный вырост, и использовать его для пересадки на другую чашку Петри. Как только вы получите устойчиво растущий, без секторов, мицелий, можете использовать его для инокуляции субстрата. Не забывайте делать высевы для сохранения линии!
Идеи к ведению культуры мицелия без агара.
Агар вероятно самый дорогой компонент, используемый при культивировании мицелия. Не смотря на то что, относительно просто следовать приведенным методикам работы с агаром, множество начинающих грибников избегают работать с собственными грибными линиями из-за отсутствия опыта работы с агаром. В качестве альтернативы, я предлагаю один из способов выращивания грибных культур — на сером картоне. Серый картон дешев и доступен, а так же не содержит перекисеразрушающих ферментов. В отличие от рифленого картона, серый картон достаточно мягок и хорошо намокает. Он так же хорош как питательная среда для мицелия, способен поддерживать быстрый рост даже в тех случаях, когда отсутствуют другие питательные вещества. В случае необходимости, питательные вещества легко добавить в него.
Так, вместо того, чтобы отвешивать все необходимые вещества для приготовления агаровой среды, плавить агар, медленно охлаждать для добавления перекиси, заливать в чашки и ждать их отвердения и просушки, вы можете просто обрезать картон по размерам чашки и пропитать его водой или необходимым питательным раствором. После заливки картонных дисков, стерилизуйте их в скороварке 10 мин.
Если вам трудно достать серый картон, то его можно заменить газетной бумагой. Но эта замена имеет некоторые недостатки по сравнению с серым картоном. С одной стороны трудно контролировать рост мицелия из-за неравномерности окраски газетной бумаги. Когда мицелий растет на бумаге, он может быть тонким как паутинка, и располагаться преимущественно на нижней, скрытой стороне. Кроме того, рост мицелия редко проявляется в виде четких круговых ареолов, таких как вырастают на агаре. Так же наблюдается неравномерный рост мицелия между слоями бумаги.
Я еще не выяснил, может ли мицелий неоднократно расти на смоченном картоне без дополнительных питательных веществ. Ожидаемо, что рост на картонных дисках замедлится без внесения дополнительных источников азота. Для длительных пересадок на картонных дисках я рекомендую добавлять в раствор источник азота.
Как подготовить пластины.
Вот детальное описание методики подготовки картонных дисков. Заметьте, что вместо чашек Петри, вы можете использовать любую подходящую посуду.
1. Отмерьте примерно 100 мл. воды из под крана в маленькую банку.
2. Для приготовления питательной среды, возьмите другую маленькую банку, налейте в нее 100 мл. воды из под крана и добавьте туда чайную ложку патоки (меда) или солодового порошка.
3. Найдите небольшой лист серого картона, чем толще, тем лучше. Предпочтительно с двусторонней серой окраской. Вырежьте из него несколько дисков в размер чашек Петри.
4. Взвесьте один картонный диск и запишите его вес. Умножьте этот вес примерно на 1,3 (с разным картоном возможны разные варианты) и добавьте высчитанный вес воды или питательного раствора к каждому диску в чашку Петри.
5. Закройте чашки крышками и дайте им пропитаться.
6. Стерилизуйте чашки в скороварке под давлением 10 мин. (прежде чем закрыть клапан, продуйте скороварку паром 10 мин.).
7. Охладите скороварку и выньте чашки.
8. Когда вода охладилась, добавьте в банку со стерилизованной водой в расчете на каждую чашку 3,3 мл. 3 % раствора перекиси водорода используя пастеризованную кипятком пипетку. Концентрация перекиси должна составлять примерно 0,1 %.
9. Добавьте в каждую чашку 0,1 % раствора перекиси примерно треть от веса картона, после этого чашки готовы к использованию.
Вы можете хранить чашки с дисками в
