Среди бактерий в биотехнологии применяют представителей таких родов, как:
1) Acetobacter, превращающих этанол в уксусную кислоту, а уксусную кислоту – в углекислый газ и воду;
2) Bacillus – для получения ферментов (В. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis);
3) Clostridium – для сбраживания сахаров в ацетон, этанол, бутанол;
4) молочнокислые бактерии (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus);
5) псевдомонады (например, P. denitrificans – для получения витамина В2, Corynebacterium glutamatum – для получения аминокислот и др.).
Актиномицеты (род Streptomyces), грибы Penicillium chrysogenum, Cephalosporium acremonium и иные применяются в биотехнологии для получения разнообразных антибиотиков.
Кроме того, бактерии, дрожжи и вирусы используют в качестве рецепиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов – продуцентов биотехнологической продукции. Например, получены рекомбинантные штаммы Е. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа; штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы дрожжей, продуцирующих интерлейкин-2, антиген вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др.
Для получения вакцин и диагностических препаратов используют и патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии, столбняка и др.).
Культуры животных и растительных клеток, строение, физиология, процесс культивирования которых являются более сложными, чем бактериальных клеток, также нашли широкое применение в биотехнологии. Тем не менее из культур тканей растений получают разнообразные соединения, используемые в медицине, и прежде всего алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и противоопухолевые, противобактериальные, сердечные и почечные средства, ферменты, витамины, опиаты и иное, сельском хозяйстве, химической и других отраслях промышленности. Кроме того, животные клетки используют не только для получения продукции, синтезируемой клетками, но и для выращивания в клетках вирусов с целью получения из них вакцин и диагностических препаратов.
Основными условиями успешного проведения технологического процесса получения продуктов микробного или клеточного синтеза являются:
1) выбор или получение высокопродуктивного промышленного штамма-продуцента и поддержание его в активном состоянии. Это обусловлено тем, что различные штаммы могут иметь существенные различия по количеству и качеству продукции того или иного вещества, что в значительной мере сказывается на экономической эффективности и активности целевого продукта;
2) подбор питательных сред, которые смогли бы обеспечить максимальное накопление биомассы или целевого продукта. При этом питательные среды должны состоять из дешевого, недефицитного и доступного сырья. С этой целью в крупномасштабном производстве для приготовления питательных сред служит обычно сравнительно дешевое сырье, которым являются меласса, парафины нефти, дрожжи, уксусная кислота, природный газ. При получении медицинских препаратов применяются казеин, препараты крови, среды из мясных гидролизатов.
С целью получения продукции в максимальных количествах активный штамм-продуцент выращивают на оптимальной питательной среде в оптимальных условиях культивирования. Выращивание проводят в ферментаторах, или культиваторах, вместимость которых может варьировать от 2 л до 100–400 м3 в зависимости от потребности в продукте. Процесс культивирования ведется в асептических условиях, чтобы получить чистые культуры целевых микроорганизмов или культуры клеток.
В ферментаторах применяют суспензионное (глубинное) культивирование, реже поверхностное – на плотных питательных средах (бактерии, грибы) или в жидком монослое (культуры животных клеток).
Полученную биомассу микроорганизмов или культуры клеток подвергают переработке, вид которой определяется технологией получения целевого продукта.
Наиболее типовые процессы:
1) концентрирование биомассы сепарированием, центрифугированием и приготовление из нее жидкого или сухого продукта;
2) высушивание, проводимое лиофильным способом из замороженного состояния или путем распыления в потоке теплого воздуха в специальных лиофильных аппаратах и распылительных сушилках;
3) сбор центрифугата после отделения биомассы и выделения из нее целевого продукта. В некоторых случаях предварительно прибегают к разрушению клеток механическим, осмотическим или ультразвуковым способом с целью увеличения выхода целевого продукта.
Если из биомассы или центрифугата необходимо выделить активную субстанцию (витамин, аминокислоту, антиген, фермент и др.), то применяют многоступенчатые физические (сепарирование, центрифугирование) или физико-химические (осаждение нейтральными солями, спиртом, ацетоном, ультрафильтрацию, хроматографию, электрофорез) методы очистки, выбор которых зависит от свойств выделяемого вещества, зависящих от природы, молекулярной массы, лабильности к внешним воздействиям и т. д. Чистота получаемого продукта определяется наличием в нем примесей и выражается коэффициентом очистки – отношением числа активных единиц продуктов к 1 мг белка или азота (так называемая удельная активность) в очищенном препарате к удельной активности исходного продукта.
Как правило, в препаратах активная субстанция содержит примеси питательных сред, на которых выращивали микроорганизмы, а также продукты метаболизма и продукты распада микробной клетки. К примесям относятся белки, полисахариды и их комплексы, нуклеиновые кислоты, соли и другие низкомолекулярные вещества – бесполезные для препаратов, но нередко вызывающие нежелательные побочные реакции организма при применении препаратов в виде местных реакций, повышения температуры тела, аллергических проявлений. Этим объясняется стремление к получению препаратов, содержащих активную субстанцию в максимально очищенном состоянии.
После получения активной субстанции из нее конструируют конечный препарат, который в зависимости от назначения и способа применения может быть в жидком или сухом состоянии или в виде мазей. Поскольку он может быть предназначен для наружного, парентерального или энтерального, аэрозольного применения, то может быть стерильным и нестерильным.
Кроме того, конечный препарат, помимо примесей (от которых не удалось освободиться), содержит и необходимые добавки, которыми являются консерванты для поддержания стерильности препарата при хранении, стабилизаторы для повышения устойчивости лабильного активного начала при хранении, активаторы.
В конечной композиции препарат фасуется, этикетируется и снабжается инструкцией по применению.
Каждая серия препарата проходит стандартизацию в соответствии с технической документацией на производстве и в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича или в Фармакологическом комитете в зависимости от назначения препарата.
Тема 9. Генная инженерия и область ее применения в биотехнологии
1. Понятие и сущность генной инженерии
Основой биотехнологии является генная инженерия, которая по существу сводится к генетической рекомбинации (т. е. обмену генами между двумя хромосомами), приводящей к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации заключается в:
1) выделении ДНК из разных видов организмов или клеток;
2) получении гибридных молекул ДНК;
3) введении рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки;
4) создании условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами.
Гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются из хромосом или плазмид, прицельно выщепляются из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции или синтезируются химически. Набор ферментов, способных резать ДНК по определенным связям, является важным инструментом генетической инженерии. В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК наподобие рестрикции ДНК, поэтому их называют рибозимами, но их роль пока до конца не изучена.
С помощью химического синтеза могут быть получены сравнительно небольшие гены. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, так как каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида. С помощью синтезатора химическим путем создают ген, аналогичный природному гену.
Полученный таким образом целевой ген сшивают с другим геном с помощью ферментов лигаз. В дальнейшем он используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений.
