Количество плазмид в бактериальной клетке может колебаться от одной до нескольких сотен и зависит от размера плазмиды: чем большие размеры она имеет, тем меньше ее копий в клетке. С помощью ампфликации генов (увеличения числа копий определенного гена в клетке) можно резко повысить производство кодируемого вещества клеткой.
Бактериофаг как вектор используется аналогично. Целевой ген встраивается в геном фага, реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего используется фаг ламбда, содержащий ДНК из 50 000 пар нуклеотидов. Его преимущество перед плазмидами заключается в том, что фаговый вектор позволяет клонировать большие фрагменты чужеродной ДНК.
В случае использования в качестве векторов вирусов человека, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса. Он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке.
Применяют в качестве вектора и космиды – гибрид плазмиды с фагом, использующийся для клонирования больших фрагментов ДНК эукариот.
Для РНК-содержащих вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы, передающей информацию о структуре белка от РНК к ДНК, являющейся комплементарной РНК.
Получение рекомбинантных молекул ДНК и рекомбинантных бактерий сводится к тому, что экспрессируемый ген в виде рекомбинантной ДНК встраивается в бактериальную или животную клетку, приобретающую новое свойство – способность продуцировать несвойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном. Для лучшего проникновения вектора через стенку бактерий иногда прибегают к воздействию на стенку (например, хлоридом кальция), чтобы увеличить ее проницаемость.
В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы с учетом возможности встройки чужеродного гена, а также уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования, экологической безопасности. Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего синтетического потенциала, поэтому они нашли применение в биотехнологической промышленности и называются промышленными штаммами.
Некоторые штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду. В таких случаях применяют дезинтеграцию, или разрушение, клетки с целью высвобождения из нее синтезированного продукта.
В некоторых случаях, несмотря на наличие экспрессии и секреции, продукт не удается получить из-за разрушения в процессе синтеза или после него протеазами и другими ингибиторами.
С целью повышения уровня секреции целевого белка к гену целевого белка присоединяют ген белка, хорошо секретируемого клеткой рецепиента. В результате образованный химерный белок, хорошо секретируемый клеткой, собирают и от него отщепляют целевой белок. Также возможно присоединение гениндикатора к гену целевого белка, в результате чего получают химерный индикаторный белок, а из него – целевой белок.
2. Биологические препараты, полученные методом генной инженерии
Несмотря на то что методом генной инженерии получена не одна сотня препаратов, в практику внедрена только часть: интерфероны, интерлейкины, фактор VIII, инсулин, гормон роста, тканевый активатор плазминогена, вакцина против гепатита В, моноклональные антитела для предупреждения отторжения при пересадках почки, диагностические препараты для выявления ВИЧ и др. Это обусловлено несколькими факторами.
1. Невозможность управлять распространением экологически опасных рекомбинантных микроорганизмов, хотя в последнее время эти опасения отвергнуты;
2. Использование рекомбинантных штаммов продуцентов предусматривает разработку сложных технологических процессов по получению и выделению целевых продуктов, на которую уходит значительное количество времени, а также средств.
3. При получении препаратов методом геннной инженерии требуется проведение исследовательских работ, направленных на доказательство идентичности, а также иногда – решение дополнительных задач по приданию продукту природного характера.
Медицинскими препаратами, разрабатываемыми методами современной биотехнологии, являются антикоагулянты и тромболитики – тканевые активаторы плазминогена, фиксаторы VIII и IX; колониестимулирующие факторы – соматомедин С, гранулоцитный и макрофагальный колониестимулирующие факторы; иммуноцитокины – интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухолей, пептиды вилочковой железы и иные; гормоны – гормоны роста, инсулин, эритропоэтин; вакцины против ВИЧ-инфекции, малярии, гепатита В и иные; ферменты – липаза, протеазы; рецепторы – Т-4 лимфоцитов и др.; моноклональные антитела для иммунотерапии опухолей, предупреждения реакций отторжения; диагностикумы для выявления ВИЧ-инфекции, сифилиса, гепатита В и др.
Метод генной инженерии является одним из самых перспективных при получении многих белковых биологических веществ, представляющих ценность для медицины. В области создания биологически активных веществ медицинского назначения с помощью данного метода создаются препараты второго поколения, являющиеся аналогами природных веществ, обладающими большей эффективностью действия.
При определении целесообразности и экономичности методов генной инженерии для получения медицинских или других препаратов учитываются:
1) доступность;
2) экономичность;
3) качество получаемого препарата;
4) новизна;
5) безопасность проведения работ и др.
Положительные стороны метода генной инженерии перед остальными заключаются в следующем.
1. Природный микроорганизм или животные и растительные клетки не культивируются в промышленных условиях. С целью получения диагностических препаратов или вакцин прибегают к клонированию или синтезу генов протективных антигенов, их встраиванию в легко культивируемые бактерии. При выращивании этих рекомбинантных бактерий-рецепиентов получают нужные антигены, являющиеся основой для создания диагностического препарата или вакцины.
2. Микроорганизм высоко патогенен и опасен при промышленном производстве. Так, для получения ВИЧ-диагностических препаратов и вакцин необходимые антигены получают методом генной инженерии.
3. Исходное сырье для получения препарата традиционным способом является дефицитным или дорогостоящим.
4. Метод активно используется для получения принципиально новых продуктов и препаратов, не существующих в природе. Например, только с помощью генной инженерии можно получить рекомбинантные поливалентные живые вакцины, несущие антигены нескольких микроорганизмов.
5. Метод позволяет заменить многие методы, основанные на получении продуктов in vivo, на способы получения этих продуктов in vitro. Так, если ранее диагностические, лечебные и профилактические сыворотки получали из крови иммунизированных лошадей или вакцинированных людей-доноров, то в настоящее время предпочтение отдается гибридомной технике получения антител, основанной на получении клеток-гибридов путем слияния В-лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, и миеломных (раковых) клеток, способных быстро размножаться на искусственных питательных средах и продуцировать при этом антитела к антигену, использованному для иммунизации.
6. Метод позволяет получать многие фармакологические вещества путем выращивания в промышленных условиях культур клеток лекарственных растений.
Тема 10. Антибиотики и химиотерапия
1. Химиотерапевтические препараты
Химиотерапия – лечение инфекционных и опухолевых заболеваний химическими препаратами, не являющимися продуктами реакции организма на возбудителя.
Химиотерапевтические препараты – это лекарственные вещества, используемые для подавления жизнедеятельности и уничтожения микроорганизмов в тканях и средах больного, обладающие избирательным, этиотропным (действующим на причину) действием.
Химиопрепараты должны обладать такими качествами, как:
1) хорошее растворение в воде, что обеспечивает доставку лекарственного вещества во внутреннюю среду организма. Малорастворимые или нерастворимые вещества пригодны только для местного применения, для внутреннего применения используются их соответствующие производные;
2) достаточная стабильность во внутренней среде организма при отсутствии кумулятивного эффекта (способности накапливаться в макроорганизме);
3) безвредность. Хотя любой химиотерапевтический препарат в той или иной мере оказывает побочное действие на организм человека, оно должно быть по возможности минимальным, а способность вызывать образование отклонений в развитии мутации по возможности должны отсутствовать.
