Свыкшись с материальностью генов, человек, естественно, тут же захотел заняться генной хирургией. Для этого в природе имеются ферменты рестриктазы, с высокой точностью разрезающие молекулу ДНК в определенных сайтах (сочетаниях нуклеотидов), и ферменты лигазы, «сшивающие» такие разрывы. Именно эти ферменты послужили основой для создания строго запланированных генных конструкций.
Использование рекомбинантных (перестроенных) ДНК различного происхождения составляет основу ДНК-технологий. Теоретически все 30-40 тысяч структурных генов человека и животных доступны теперь экспериментальному анализу. Поэтому желательна идентификация всех генов; составление карты тканеспецифичности их экспрессии; идентификация регуляторных областей генов; построение глобальной регуляторной карты генома; классификации генов по структурным и биохимическим функциям их продуктов; идентификация всех потенциальных белков и доменов; анализ распределения полиморфизма и мутаций; определение эволюционных и популяционных взаимосвязей; создание коллекции генетического материала и тд.
Устойчивость нити ДНК в составе хромосом регулируется целой системой ферментов, контролирующих три матричных процесса — репликацию, транскрипцию и трансляцию, и три собственно генетических процесса — репарацию, рекомбинацию и сегрегацию нитей ДНК и хромосом. Белковые продукты «генов метаболизма ДНК» образуют комплексы, которые следят за устойчивостью нитей ДНК, надежностью их репликации и рекомбинации, корректируют однонитевые и двунитевые повреждения. Степень активности этих комплексов весьма чувствительна к физиологическому статусу клетки. Ю.Я. Керкис (1940) впервые показал, что спонтанные наследственные изменения возникают за счет нарушения внутриклеточного метаболизма и физиологического гомеостаза. Устойчивость ДНК и темп мутаций могут в случае клеточного стресса меняться в десятки и сотни раз.
Началом эры генной инженерии растений принято считать 1973 год, когда впервые был проведен целенаправленный перенос гена. Фактически генная инженерия продолжает направление традиционной селекции сельскохозяйственных культур, однако достигает поставленных целей намного быстрее. Основные отличия генетической инженерии от традиционной селекции заключаются в том, что улучшение свойств культурных растений достигается либо улучшением существующей, либо созданием новой генетической вариации. При использовании традиционных методов скрещивания гарантия получения искомой комбинации генов, то есть желаемого признака у растения, практически отсутствует.
Прогресс современной науки во многом определяется и в решающей степени зависит от экспериментальной и практической реализации новых идей и подходов в клеточной и молекулярной биологии. Химерные и трансгенные животные и растения — это наиболее яркое подтверждение потенциальных возможностей фундаментальной и прикладной науки. Такие организмы стали основными инструментами в исследованиях функций генов, процессов дифференцировки, эмбрионального развития, клеточной гибели и старения. Несомненный прорыв в деле создания химерных и трансгенных организмов связан с разработкой ЭСК-технологий и микрохирургической техники работы на изолированных зародышах. В этих технологиях эмбриональные стволовые клетки стали связующим звеном между системами in vitro и in vivo, что дало возможность легко переносить результаты исследования с клеточного уровня на уровень целого организма. При этом значительно повысилась эффективность метода трансгеноза — до 40-50% по сравнению с 1% при использовании техники инъекции чужеродной ДНК (генов) в пронуклеусы зародыша на стадии зиготы.
ДНК-технологии позволяют исследовать и направленно изменять материал наследственности на разных уровнях его организации — генном, хромосомном, геномном, популяционно-генетическом. Интересно, что в смысле управления наследственностью «генетическую инженерию» использовали в течение тысячелетий безымянные селекционеры, благодаря которым еще в эпоху неолита и было введено в культуру абсолютное большинство возделываемых в настоящее время видов растений.
Переходя непосредственно к описанию методов генетической трансформации, отметим, что на сегодняшний день молекулярная генетика располагает значительным набором знаний и приемов для осуществления переноса генов из одних организмов в другие. Технология создания трансгенных растений включает большое количество этапов, среди которых можно выделить: получение целевых генов, создание векторов; трансформацию растительных клеток; подтверждение трансформации молекулярно-биологическими методами — обнаружение функционирующего целевого гена; регенерация целого растения из трансформированных клеток.
Подготовительный этап: конструирование вектора. На первом этапе конструирования рекомбинантной ДНК готовят вставки, пригодные для последующего соединения с вектором. В настоящее время наиболее часто используются 3 метода их получения: из фрагментов геномной ДНК; путем ферментативного или химического синтеза фрагментов ДНК; из сегментов ДНК, полученных с помощью ферментативного копирования РНК-матрицы in vitro.
В качестве вектора, которым может быть любой небольшой внехромосомный элемент (плазмида, ДНК фага или вируса), для трансформации растительных клеток обычно используют бактериальные плазмиды.
Следует отметить, что в большинстве случаев целевой ген подвергается модификации, поскольку, несмотря на универсальность генетического кода (он одинаков для всех организмов вне зависимости от уровня их организации), состав триплетов, кодирующих одни и те же аминокислоты у организмов, принадлежащих к разным видам, имеет некоторые отличия.
Замена кодонов никоим образом не сказывается на первичной структуре белка, в то время как экспрессия гена может быть усилена в сотни раз. Необходимый уровень экспрессии целевого гена в клетках растения достигается посредством использования соответствующих регуляторных элементов, контролирующих работу гена, — промоторов и терминаторов.
Следует отметить, что среди известных в настоящее время промоторов один из самых сильных — промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, поэтому в большинстве случаев именно его используют в качестве регулятора экспрессии целевого гена.
Таким образом, вносимая генетическая конструкция (вставка или кассета экспрессии) — это группа функционально связанных участков ДНК, состоящая из высокоактивного промотора, непосредственно за которым располагаются соответствующий целевой ген и терминатор транскрипции. После получения вектора и вставки начинается процесс конструирования рекомбинантной ДНК. Полученные молекулы ДНК вводят в бактериальные клетки для клонирования, что приводит к накоплению рекомбинантной ДНК. Эффективное увеличение количества ее копий возможно лишь при обеспечении оптимальных условий существования вектора, использующего метаболиты, ферменты и другие белки клетки-хозяина, а также ее аппарат белкового синтеза, поэтому основной инструмент молекулярного клонирования — совместимая комбинация хозяина и вектора. Наиболее широко применяются такие сочетания, когда в роли хозяина выступает штамм E.coli, а в роли вектора — его плазмида. Проникновение вектора в живые клетки E.coli проходит наиболее эффективно при условии повышенной проницаемости клеточных мембран, обусловленной, например, их локальным разрушением. Нарушение их целостности достигается либо воздействием электрического тока — электропорацией, либо посредством обработки клеток определенными химическими веществами, после чего перенос вектора происходит в течение нескольких минут. Векторы обычно содержат маркерные гены, благодаря которым осуществляется отбор клеток с измененным генотипом. Например, клетки, чувствительные к определенному антибиотику или токсину, можно использовать в комбинации с векторами, содержащими гены устойчивости к этим агентам. Выращивая микроорганизмы в условиях, при которых проявляется зависимость от маркерных генов, можно отобрать и размножить клетки, несущие требуемый генетический материал.
Методология прикладного использования ДНК-технологий
ДНК-технология или генная (генетическая) инженерия — направление исследований в генетике, в рамках которого разрабатывают приемы, позволяющие по заранее намеченному плану перестраивать геном организмов (совокупность генетических элементов организма), изменяя в нем генетическую информацию. С помощью рестриктаз и лигаз получают перестроенные (химерные) молекулы ДНК. Их еще называют рекомбинантными — полученными в результате объединения in vitro в природе никогда вместе не существующих фрагментов ДНК (например, ДНК бактерии и растения). Живую систему для размножения рекомбинантных молекул выбирают среди бактерий. Получение рекомбинантных ДНК в количестве, необходимом для проведения генетической модификации, позволяет перейти непосредственно к ключевому этапу получения ГМ культур: трансформации растительных клеток. В идеале трансформационная система должна отвечать определенным условиям: быть простой, эффективной и дешевой. Однако, несмотря на сравнительно широкий выбор методических приемов, всем требованиям не соответствует ни один из них. Тем не менее в настоящее время для производства трансгенных культур в промышленных масштабах в основном применяются два способа модификации растительного генома — агробактериальный (то, как это делается в природе, см. выше) и баллистический, баллистическая трансформация растительных клеток (еще называемый микробомбардировкой, методом ускорения частиц, биолистикой — термин, произошедший от объединения слов «биология» и «баллистика») состоит в «обстреле» растительных клеток золотыми или вольфрамовыми частицами, которые играют роль переносчика рекомбинантной ДНК. В сущности, микрочастицы могут быть из любого химически инертного металла с достаточно высокой молекулярной массой (золото, вольфрам, палладий, родий, платина, индий), чтобы не образовывать с ДНК металлорганических комплексов и обладать достаточно высокой кинетической энергией для эффективной пенетрации клеточной стенки. Частицам размером 1,5-3 микрона, конъюгированным с ДНК, придается скорость 300-600 м/сек посредством электрического разряда или декомпрессии в направлении клеток-мишеней, подлежащих трансформации. Несмотря на то, что эффективность этого способа невысока (не более 15%), баллистический метод — весьма распространенный прием трансформации однодольных растений.
