Биосинтез антибиотиков, как и других вторичных метаболитов, как правило, происходит в клетках, прекративших рост (идиофаза). Биологическая роль их в обеспечении жизнедеятельности клеток-продуцентов остается до конца не исследованной. Специалисты, изучающие перспективы биотехнологии в области микробиологического производства антибиотиков, считают, что они в неблагоприятных условиях подавляют рост конкурирующих микроорганизмов, обеспечивая тем самым более благоприятные условия для выживания микроба-продуцента того или иного антибиотика. Значение процесса антибиотикообразования в жизнедеятельности микробной клетки подтверждается тем, что у стрептомицетов около 1% геномной ДНК приходится на долю генов, кодирующих ферменты биосинтеза антибиотиков, которые в течение продолжительного времени могут не экспрессироваться. Продуцентами известных антибиотиков в основном являются шесть родов нитчатых грибов, три рода актиномицетов (почти 4000 различных антибиотиков) и два рода истинных бактерий (примерно 500 антибиотиков). Из нитчатых грибов особое внимание следует обратить на плесневые грибы родов Cephalosporium и Penicillium, являющиеся продуцентами так называемых бета-лактамных антибиотиков — пенициллинов и цефалоспоринов. Большая часть актиномицетов, синтезирующих антибиотические вещества, включая тетрациклины, относится к роду Streptomyces.
Из известных 5000-6000 природных антибиотических веществ для реализации потребителям производится только около 1000. В то время, когда установили антибактериальное действие пенициллина и возможность его использования в качестве лекарственного препарата (Х.У. Флори, Э.Б. Чейн и др., 1941), продуктивность лабораторного штамма плесени — 2 мг препарата на 1 л культуральной жидкости — была явно недостаточной для промышленного производства антибиотика. Многократными систематическими воздействиями на исходный штамм Penicillium chrisogenum такими мутагенами, как рентгеновское и ультрафиолетовое облучение, азотистый иприт в сочетании со спонтанными мутациями и отбором наилучших продуцентов, удалось увеличить продуктивность гриба в 10 000 раз и довести концентрацию пенициллина в культуральной жидкости до 2%.
Путь повышения эффективности штаммов-продуцентов антибиотиков, основанный на беспорядочных мутациях и ставших классическим, несмотря на колоссальные затраты труда, используется до настоящего времени. Создавшееся положение является следствием того, что антибиотик, в отличие от белка, не является продуктом конкретного гена; биосинтез антибиотика происходит в результате совместного действия 10-30 разных ферментов, кодируемых соответствующим количеством разных генов. Кроме того, для многих антибиотиков, микробиологическое производство которых налажено, молекулярные механизмы их биосинтеза до сих пор не изучены. Полигенный механизм, лежащий в основе биосинтеза антибиотиков, является причиной того, что изменения отдельных генов не приводят к успеху. Автоматизация рутинных приемов анализа продуктивности мутантов позволяет изучить десятки тысяч функционирующих штаммов и тем самым ускоряет процедуру отбора при использовании классического генетического приема.
Новая биотехнология, основанная на использовании штаммов-суперпродуцентов антибиотиков, предполагает совершенствование механизмов защиты продуцента от синтезируемого им антибиотика.
Высокую продуктивность проявляют штаммы, устойчивые к действию высоких концентраций антибиотиков в культурной среде. Это свойство также учитывается при конструировании клеток-суперпродуцентов. Со времени открытия пенициллина в конце 1920-х годов из различных микроорганизмов были выделены более 6000 антибиотиков, обладающих разной специфичностью и разным механизмом действия. Их широкое применение для лечения инфекционных заболеваний помогло сохранить миллионы жизней. Подавляющее большинство основных антибиотиков было выделено из грамположительной почвенной бактерии Streptomyces, хотя их продуцируют также грибы и другие грамположительные и грамотрицательные бактерии. Ежегодно во всем мире производится 100 000 т антибиотиков на сумму примерно S млрд. долларов, в том числе более 100 млн. долларов приходится на долю антибиотиков, добавляемых в корм скоту в качестве добавок или ускорителей роста.
По оценкам, каждый год ученые обнаруживают от 100 до 200 новых антибиотиков, прежде всего в рамках обширных исследовательских программ по поиску среди тысяч различных микроорганизмов таких, которые синтезировали бы уникальные антибиотики. Получение и клинические испытания новых препаратов обходятся очень дорого, и в продажу поступают только те из них, которые имеют большую терапевтическую ценность и представляют экономический интерес. На их долю приходится 1-2% всех обнаруживаемых антибиотиков. Большой эффект здесь дает технология рекомбинантных ДНК. Во-первых, с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Во-вторых, генноинженерные подходы могут использоваться для увеличения выхода антибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства.
Можно считать, что клиническая биотехнология зародилась с началом промышленного производства пенициллина в 40-х гг. и его использования в терапии. По-видимому, применение этого первого природного пенициллина повлияло на снижение заболеваемости и смертности больше, чем какого-либо другого препарата, но, с другой стороны, поставило ряд новых проблем, которые удалось решить опять-таки с помощью биотехнологии.
Во-первых, успешное применение пенициллина вызвало большую потребность в этом лекарственном препарате, и для ее удовлетворения нужно было резко повысить выход пенициллина при его производстве. Во-вторых, первый пенициллин — С(бензилпенициллин) — действовал главным образом на грамположительные бактерии (например, Streptococci и Staphylococci), а нужно было получить антибиотики с более широким спектром действия и/или активностью, поражающие и грамотрицательные бактерии типа E.coli и Pseudomonas. В-третьих, поскольку антибиотики вызывали аллергические реакции (чаще всего незначительные, вроде сыпи на коже, но иногда и тяжелее, угрожающие жизни проявления анафилаксии), необходимо было иметь целый набор антибактериальных средств, с тем чтобы можно было выбрать из равноэффективных препаратов такой, который не вызывал бы у больного аллергию. В- четвертых, пенициллин нестабилен в кислой среде желудка, и его нельзя назначать для приема внутрь. Наконец, многие бактерии приобретают устойчивость к антибиотикам. Классический пример тому — образование стафилококками фермента пенициллиназы (правильнее, бета-лактамазы), который гидролизует амидную связь в бета-лактамном кольце пенициллина с образованием фармакологически неактивной пенициллоиновой кислоты. Увеличить выход пенициллина при его производстве удалось в основном благодаря последовательному использованию серии мутантов исходного штамма Penicillium chrysogenum, а также путем изменения условий выращивания.
Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из десятков ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза — задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор транс формантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержащего функциональный экс премирующийся ген антибиотика (т.е. ген, восстанавливающий утраченную мутантным штаммом функцию), и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь, по крайней мере, по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров.
С помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, а затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза, определить их N-концевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Этот подход использовался для выделения из Penicillium chrysogenum гена синтетазы изопенициллина N. Этот фермент катализирует окислительную конденсацию 5-(1_-а-аминоадипилН— цистеинил-Р-валина в изопенициллин N, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов.
