можно добавлять 0,1 гр 60–80 % сульфата гентамицина (см. Приложение VII).
Качество воды, её pH и минеральный состав отличаются в зависимости от региона. Если качество вашей воды находится под сомнением, рекомендуем использовать дистиллированную воду. Для практических нужд, тем не менее, сгодиться и вода из водопровода, без особого вреда для мицелия. В некоторых случаях сбалансированный уровень pH важен, например, для проращивания спор или разведения мицелия экзотических видов грибов. Изменить pH носителя можно добавляя в него по капле соляной кислоты (HCL) или каустическую соду (NaOH) (вероятно сойдет уксус и пищевая сода — прим. ред.). Затем основательно перемешав состав, нужно снова измерить его уровень pH. (pH соляной кислоты — 0; pH каустической соды — 12; pH дистиллированной воды — 7).
Тщательно смешав все ингредиенты стерилизуйте состав в скороварке в течении 30 минут при давлении в 1,05 атм (15 psi).
(Скороварка является безопасным и эффективным средством стерилизации субстратов при условии использования строго в соответствии с инструкцией производителя — многие производители настолько помешаны на безопасности скороварок, что из-за всех их причиндалов, их скороварки вообще никуда не годятся, но изображенная на фотографии является неплохой — прим. ред.). Для автоклавирования агара рекомендуем использовать колбу с узким горлом. Если у вас нет специально приспособленного для этого сосуда, подойдёт любая похожая по форме бутылка.
Обязательно заткните горлышко ватным тампоном и прикройте сверху фольгой до помещения в скороварку.
Колбу можно наполнить только на 2/3-3/4 от полного объёма.
Наполненный сосуд поместите в скороварку налив достаточное для образования пара количество воды. (Обычно достаточно 1 см от дна). Приведите скороварку в рабочее состояние следуя инструкции производителя. Поставьте её на огонь и дождитесь появления густой струи пара. Выждав 4–5 минут закройте паровой клапан. Медленно поднимите давление до 1,05 ат (15 psi) и поддерживайте его в течении получаса. Не позволяйте температуре подниматься выше 121 °C, в противном случае сахар в агаровой среде карамелизуется. Карамелизованный сахар в носителе подавляет рост мицелия и повышает вероятность генетических мутаций.
В лаборатории следует иметь стерильную тряпичную ухватку или кусок свежевыстиранной ткани для удобства обращения с горячей посудой с агаром.
Время необходимое для стерилизации разнится в зависимости от высоты над уровнем моря. В неизменном объёме существует прямая зависимость между давлением и температурой (известная как закон Бойля-Мариотта). Когда рекомендуется определённое давление (равно как и температура), оно основано на стандартной высоте над уровнем моря. Культиваторам, проживающим в местах расположенных значительно выше уровня моря (например на Эвересте — прим. ред.), придётся стерилизовать дольше и при более высоком давлении, чтобы достигнуть того же эффекта. Ниже приведена сокращённая таблица, показывающая зависимость между давлением и температурой, и изменение температуры закипания воды на различных высотах. Увеличивайте рекомендованное давление исходя из температуры кипения воды зависящей от вашего положения над уровнем моря. К примеру на высоте в 1,5 километра температура кипения воды снизится приблизительно на 5,5 °C. Это значит что давление необходимо увеличить до 1.4 ат (20 psi), т. е. на 0,35 от рекомендуемых 1,05 ат (15 psi). Смотрите в таблице требуемое давление при изменении температуры на 5 °C. (На самом деле температура остаётся прежней, а вот давление изменится).
http://sci.aha.ru/ALL/bl7.htm — зависимость температуры кипения воды от давления
Заметьте что эффект стерилизации получаемый при кипячении в течении 60 минут с давлением в 1,05 атм (15 psi) будет таким же от 30 минут с 2.1 ат (60 psi). Таким образом увеличение давления вдвое сократит время стерилизации вполовину. Но большинство скороварок не могут работать с таким давлением. Ещё некоторое время всё-таки стоит прибавить для достаточно хорошего проникновения пара в субстрат, особенно если используется большой и плотно Загруженный автоклав (Прим. ред.: Не морочьте голову, большинство скороварок рассчитано на 1 атм давления пара. Если стерилизуемое богато микрофлорой и спорами, то следует стерилизовать 1,5 часа. Если стерилизуемое нестойко к температуре — то 15 мин. В остальных случаях 30–60 мин.).
После стерилизации поместите скороварку в лабораторию или комнату с условиями близкими к стерильным и, до того как откроете, дайте давлению в ней выровняться с атмосферным (то есть дайте остыть немного, а то при открывании все закипит; наличие давления можно проверять, слегка открывая клапан скороварки — прим. ред.). Одним литром агара можно сполна залить 30 чашек Петри размером 100 х 15 мм. Способы разлива агара отличаются от грибовода к грибоводу. Если нужно разлить только одну или две стопки по десять чашек, их можно разложить на рабочем столе все рядом. Если необходимо приготовить больше чем две стопки или поверхность рабочего стола ограничена, тогда более удобно будет разливать, перемещая чашки из стопки в стопку.
Прим. ред.:
При работе со спиртовым факелом (даже не в боксе), его в этом случае нужно создавать на металлической крышке от какой-либо банки. Простерилизованную чашку Петри нужно ставить на какую-нибудь более высокую металлическую банку (из-под растворимого кофе, например), как можно ближе к факелу, чтобы поднимающий над пламенем горячий стерильный воздух не давал возможности приблизится к чашке спорам и микроорганизмам, содержащимся в воздухе помещения. Свежевымытые, и еще слегка влажные, чашки Петри стерилизуются в скороварке. Для стерилизации их обычно заворачивают в плотную (от бумажных мешков) бумагу, несколько штук в одну упаковку. Поставьте в скороварку какую-нибудь подставку, чтобы упаковка не намокала. Конечно, речь идет о стеклянных чашках Петри. Пластмассовые, как правило, одноразовые, уже стерильны. Последние пригодны для работы только в ламинарных боксах.
Пробирки достать легче, чем чашки Петри. Лучше ориентироваться на них. Пробирки закрываются ватными пробками. Для изготовления ватных пробок, разложите вату слоем, слегка обрызгайте водой и скатайте в плотный рулон. Обычно из рулона можно нарезать несколько, 2–4, пробок. На каждую натяните кусок марли, завяжите ниткой или тонкой бечевкой. Лишний хвостик марли удалите, он может вспыхнуть в пламени. После этого пробки нужно высушить каким-либо способом, иначе они могут заплесневеть. Или же только подсушить и сразу простерилизовать их. Пробирки стерилизуются также как чашки Петри. Чтобы пробки не намокали — верх каждой пробирки оборачивают плотной бумагой и обвязывают тонкой бечевкой или резинкой. Некоторые используют толстую фольгу. Многие помещают пробирки в скороварку для стерилизации в самодельном ведерке, сделанном из какой-либо металлической банки.
Если же не будет даже пробирок, то попробуйте использовать какие-нибудь маленькие бутылочки. Работать с ними хуже, стекло не термостойкое, при работе может пойти трещинами.
Перед разливом энергично взболтайте колбу с расплавленным агаром для равномерного распределения питательных веществ. Опытные культиваторы наполняют чашки в темпе
