И ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНОГ0 ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА.
Работа 1. ВЫЧЛЕНЕНИЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ И РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ.
Объяснение. В культуре тканей можно размножать растения и получать оздоровленный (безвирусный) посадочный материал. Для оздоровления растений используют культуру апексов или культуру апикальных меристем, так как в стеблевой апекс вирусы проникают медленнее, чем в другие части растений. При культивировании апексов размножение вирусов подавляется реакцией растительного организма на травму, вызванную отсечением верхушки. Обычно на питательные среды высаживают небольшую часть меристемы до 0,5 мм.
В целом закономерность такова: чем меньше величина меристемы, тем больше вероятность получения безвирусных растений.
Биотехнология позволяет получать безвирусный оздоровленный посадочный материал практически всех сельскохозяйственных культур. Наиболее полно разработана технология получения безвирусного картофеля. Система первичного семеноводства и оздоровления посадочного материала картофеля включает следующие этапы: подготовка клубней для вычленения апикальных меристем, вычленение апикальных меристем, регенерация растений из меристем, адаптация растений-регенерантов в защищенном грунте, получение первой продукции безвирусного материала в открытом грунте, выращивание безвирусного посадочного материала в первичных звеньях семеноводства, сохранение коллекции сортов.
В культуре тканей используются апексы верхушечных и боковых почек. Чтобы исключить влияние метаболитов клубня на проростки и повысить регенерационную способность исходного материала из средней части клубня вырезают глазки с частью паренхимы (1,5 х 1,5 см). Глазки проращивают на песке, предварительно обработанном сухим жаром. Этиолированные проростки выращивают в темноте при температуре 25 + 2 °C, влажности воздуха 70–80 %. Песок дважды в день увлажняют, через 7-10 дней проводят подкормку раствором Кнопа.
Апикальные меристемы проростков изолируют на 12–13 пластохроне[1]. Изолированные меристемы культивируют в асептических условиях на питательных средах с богатым содержанием макро- и микросолей, с повышенной концентрацией цитокининов (6-ЕАП 2 мг/л). В культуральной комнате с кондиционированным воздухом поддерживают температуру 25 + 2 °C, влажность воздуха 70 %, освещенность 5 kLx и фотопериод 16 часов.
В среднем от посадки меристемы на среду до формирования проростков с 5–6 листочками проходит 30–45 дней, в некоторых случаях от 2 до 8 месяцев. Среды по мере истощения обновляют, и проростки периодически пересаживают на новые среды в стерильных условиях.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бинокулярный микроскоп МБС-9 или МБС-10, флаконы со стерилизующими растворами, (0,2 % диацид или 70 % спирт), чашки Петри, стерильная дистиллированная вода, стерильные инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, скальпели, спиртовка, пробирки со средой.
Ход работы.
1. Поверхность ламинара, штативы, пробирки, микроскоп обработать ультрафиолетом и 96 % спиртом. Руки протереть спиртом. Препарировальные иглы, пинцеты, скальпели поместить в 96 % спирт и перед каждой манипуляцией обжигать на пламени спиртовки.
2. Проростки (2 см) отделить от клубней и поместить в чашки Петри со стерилизующими растворами: в диацид на 3–5 минут, в спирт на 1–2 минуты.
3. Проростки промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой и перенести в стерильные чашки Петри.
4. Тонкой препарировальной иглой у проростков удалить все листья, последовательно обнажая верхушечные и боковые меристемы с примордиями.
5. Меристему с 1–2 примордиями отделить от проростков, при этом величина экспланта должна быть не более 100–250 мкм.
6. Экспланты перенести в пробирку на поверхность питательной среды.
7. Пробирки закрыть пробками, поместить в штатив и перенести в культуральную комнату.
8. Результаты зарисовать через 2–4 недели, сделать выводы.
Работа 2. ПРОЛИФЕРАЦИЯ ПОБЕГОВ И МИКРОЧЕРЕНКОВАНИЕ СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ.
Объяснение. Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляют с помощью черенкования. Такое размножение основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушных почек на питательных средах образуются побеги. Растения, сформировавшие 5–6 листочков, в стерильных условиях извлекают из пробирок и разрезают на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой). Черенки высаживают на глубину междоузлия в питательные среды либо без гормонов, либо с добавлением ауксинов.
Черенки культивируют в тех же условиях, что и меристемы: при температуре 24–25 °C днем и 19–20 °C ночью, освещенности 5–6 kLx и продолжительности фотопериода 16 часов.
Рост стебля и корней начинается на 3–4 день после посадки на питательную среду, а полностью растения формируются через 12–15 дней.
Каждое последующее черенкование проводят через 14–20 дней. Из одного растения можно получить 5–8 черенков, а через 2–3 месяца — 3–5 тыс. черенков.
Нижнюю часть растения используют для ИФА. Растения, зараженные вирусами, бракуют, а здоровые дают начало мериклонам (меристематическим клонам).
Если почки или черенки высадить на питательные среды с высоким содержанием цитокининов, то образуется конгломерат почек и побегов. Полученные побеги легко отделяются друг от друга, их можно либо укоренить, либо использовать для дальнейшего микрочеренкования.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с проростками, пробирки с питательной средой, скальпели, препарировальные иглы, спиртовка, флакон с 96 % спиртом.
Ход работы.
1. Подготовить ламинар-бокс и инструменты к работе.
2. В ламинаре извлечь стерильные проростки из пробирок.
3. Побеги разделить на микрочеренки (междоузлие с почкой) и посадить в питательную среду на глубину междоузлия.
4. Пробирку закрыть пробкой, поместить в штатив и перенести в культуральную комнату.
5. Результаты зарисовать через 2–4 недели. Сделать выводы о степени пролиферации почек различных сельскохозяйственных культур.
Работа 3. ИНДУКЦИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ РАСТЕНИЙ.
Объяснение. Для укоренения растений, образовавшихся при микрочеренковании, их необходимо пересадить на новую питательную среду. Черенки и побеги легко укореняются на средах с обедненным составом минеральных солей (среда Уайта, Мурасиге-Скуга, разбавленная вдвое), либо на средах с добавлением ауксинов: ИУК, НУК, ИМК.
Проростки, сформировавшиеся в пробирках со средами, можно рассматривать как небольшие укорененные растения, которые необходимо адаптировать к обычным условиям выращивания. Такие растения лучше пересаживать в грунт, когда полностью сформируются 5–6 листьев и достаточно разрастутся корни. Однако, разные виды культурных растений по-разному приспосабливаются к изменению условий среды. Каждое растение требует специально подобранных условий культивирования в грунте, которые устанавливают экспериментально.
Материалы и оборудование. Пробирки с проростками, пробирки с питательными средами для индукции корнеобразования: без гормонов и с добавлением ИУК, стерильные инструменты, ламинар-бокс, спиртовки, флакон с 96 % спиртом, вата, стерильные чашки Петри.
Ход работы.
1. В стерильных условиях проростки извлечь из пробирок и стерильным пинцетом перенести в пробирки с питательными средами для укоренения.
2. Пробирки с пересаженными растениями поставить в штативы и перенести в культуральную комнату с освещением 5 kLx, температурой 25 + 2 °C и влажностью воздуха 70 %.
3. Результаты укоренения оценить через 1–4 недели, сделать рисунки.
4. Укоренившиеся растения перенести в ящики или вегетационные сосуды с торфом и песком (3:1).
Работа 4. ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОКЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO
Объяснение. В практике биотехнологии на искусственных питательных средах с определенным набором биологических регуляторов можно вызвать пролиферацию почек и побегов, укоренить их, а также индуцировать образование микроклубней. Для этого обычно используют среды с высоким содержанием минеральных солей (Мурасиге-Скуга), углеводов (сахарозы до 8 % от объема среды), цитокининов, абсцизовой кислоты, хлорхолинхлорида.
В течение первых10-12 суток
