фазе) клетки не делятся, не увеличиваются в размере, имеют низкую метаболическую активность. В экспоненциальной фазе (фазе логарифмического роста) клетки активно делятся митозом. В ранней экспоненте увеличивается количество митохондрий (синтезируется АТФ), рибосом, всех видов РНК, синтезируются белки, активизируется метаболизм, интенсивно поглощается кислород. Поздняя экспонента или фаза латентного роста, характеризуется снижением удельной скорости роста, замедлением клеточного деления, увеличением среднего размера клеток за счет растяжения. В стационарной фазе размер клеток продолжает увеличиваться, а их деление прекращается. В поздней стационарной фазе (фаза деградации) за счет истощения среды клетки стареют и умирают.
Продолжительность ростового цикла каллусных клеток 21–28 дней. В процессе культивирования каллус пассируют (пересаживают на свежую питательную среду) каждые 4–6 недель. Масса транспланта (фрагмента ткани, который пассируют на свежую питательную среду) составляет 60-100 мг на 20–40 мл среды.
Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами, пробирки с питательной средой для культивирования каллусов, инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, флакон с 96 % спиртом, ламинар-бокс, спиртовка.
Ход работы.
1. В асептических условиях извлечь каллусы из пробирок и поместить на стерильную поверхность (столик ламинар-бокса, обработанный 96 % спиртом и УФ-излучением), стерильной препарировальной иглой выделить зоны меристематической активности (белые мелкие клетки).
2. Транспланты величиной 2–3 мм поместить на поверхность питательной среды (МС+ИУК — 0,5 мг/л + кинетин — 0,5 мг/л).
3. Результаты культивирования зарисовать через 2–4 недели, по результатам взвешиваний через 1-2-3-4 недели построить график роста каллуса.
ТЕМА IV. СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ.
Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ СУСПЕНЗИИ.
Объяснение. Суспензионные культуры — это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2–3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60-100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100–120 об./мин.
Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток.
Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве.
Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с рыхлыми каллусами та бака (среда МС+2,4-Д 2 мг/л), колбы с питательной средой для инициаций суспензии, магнитные мешалки, стерильные инструменты, флакон с 96 % спиртом.
Ход работы.
1. В асептических условиях извлечь каллус из пробирки и поместить в колбу с питательной средой, из расчета 2–3 г на 100 мл среды: 1. МС+2,4-Д, 2. МС+ИУК, 3.МС+ИУК+ 6-БАЛ, 4. МС без гормонов.
2. Колбы с суспензией поместить на круговые качалки при 100–120 об./мин. и оставить на 2 недели.
3. Результаты культивирования суспензии на различных по составу средах зарисовать и сделать выводы.
Работа 2. ПОДСЧЕТ ПЛОТНОСТИ СУСПЕНЗИИ.
Объяснение. По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора инокулянта и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве случаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через 14–16 дней после начала культивирования). При построении кривой роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за 2–3 недели культивирования возрастает в 20 раз. Клетки суспензий удобнее всего подсчитывать в специальных счетных камерах Фукса-Розенталя /гемоцитомерах/. Для подсчета клеток суспензии иногда используют временные препараты, но это более трудоемкий процесс: значительно увеличивается число повторностей.
Объем выборки должен составлять не менее 1000 клеток. Подсчет клеток затрудняется, если в суспензии преобладает фракция агрегатов. В таких случаях к 1 объему культуры добавляют 2 объема 8 % оксида хрома и нагревают до 70 °C в течение 2-15 минут. После охлаждения культуру встряхивают, чтобы распались агрегаты. Для разрушения агрегатов в суспензию добавляют пектиназу — 0,25 % объема.
Плотность суспензии можно определить и по соотношению объема биомассы к общему объему суспензии. Измеряют средний объем клетки и получают число клеток в 1 мл суспензии.
Материалы и оборудование. Микроскоп, центрифуга, колба с суспензией, стерильная пипетка, предметное стекло, покровное стекло, камера для подсчета элементов крови, фильтровальная бумага.
Ход работы.
1. Колбу с суспензией встряхнуть и отобрать пипеткой несколько мл суспензии.
2. 1 мл суспензии смешать с 2 мл 8 % оксида хрома и поставить на 15 минут в термостат при температуре 70 °C.
3. Смесь пропустить 3 раза через шприц с толстой иглой (пипетировать).
4. Камеру Фукса-Розенталя заполнить суспензией.
5. Подсчитать клетки под микроскопом.
6. Плотность суспензии рассчитать по формуле:
X = М х n х 1000/3,2,
где X — число клеток в мл, М — среднее число клеток в камере, n — разведение.
Работа 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ АГРЕГИРОВАННОСТИ И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ СУСПЕНЗИИ.
Объяснение. В зависимости от целей исследования условия культивирования и состав питательной среды подбирают так, чтобы в суспензии преобладала определенная фракция клеток. Обычно в суспензии различают 4 основные фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты, средние агрегаты, крупные агрегаты. Степень агрегированности определяют, подсчитывая клетки в нескольких полях зрения на временных препаратах под малым увеличением микроскопа (не менее 1000 клеток).
При работе с суспензиями необходимо учитывать и ее жизнеспособность. О жизнеспособности клеток можно судить по движению цитоплазмы, по степени проницаемости клеточной стенки для красителей, по активности ферментов.
Прижизненные красители, такие как метиленовый синий, клетки не убивают и через оболочки живых клеток в цитоплазму не проникают. Суспензия считается жизнеспособной, если более 70 % клеток не окрашиваются в синий цвет; агрегат жизнеспособен, если более 50 % его клеток не окрасились.
Для количественного определения жизнеспособности суспензии используют вещества, участвующие в метаболизме клетки: флуоресцеиндиацетат расщепляется в клетке эстеразами с образованием флуоресцеина, дающего флуоресценцию цитоплазмы живых клеток. Активность эстеразы определяют на спектрофотометре. Окрашивание клетки солями тетразоля позволяет определить интенсивность дыхания клетки.
Материалы и оборудование. Микроскоп, флакон с 0,1 % раствором метиленового синего, предметные и покровные стекла, фильтровальная бумага, дистиллированная вода, марлевые салфетки, пипетки.
Ход работы.
1. Приготовить препарат суспензии: встряхнуть суспензию в колбе, пипеткой отобрать небольшое количество суспензии, поместить каплю суспензии на предметное стекло, добавить каплю красителя, накрыть покровным стеклом, излишки жидкости убрать фильтровальной бумагой.
2. Поместить препарат на столик микроскопа под малое увеличение объектива и подсчитать клетки и агрегаты в 3-х полях зрения (просмотреть не менее трех препаратов).
3. Результаты записать в таблицу.
4. Один препарат зарисовать, описать морфологию клеток суспензии (форму, величину).
5. Сделать вывод о степени агрегированности
