хромосом. Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. Гаплоиды по внешнему виду сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет. Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение.
Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200 видов растений.
Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия "средних" или "поздних" одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу.
Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-БАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей в питательные среды добавляют активированный уголь.
Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 4–6 °C в течение 2–8 суток. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, либо при слабом освещении при температуре 25 + 2 °C.
На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидный зародыш (сначала образуется 40-50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики.
В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов), либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды — морфогенный каллус и регенеранты.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бутоны вишни и яблони, пробирки со средою для каллусогенеза, препарировальные иглы, пинцеты, флакон с 96 % спиртом, 6 % раствор хлорамина, вата, фольга.
Ход работы.
1. Бутоны стерилизуют в 6 % растворе хлорамина 10 минут, для этого поместить бутоны в марлевый мешочек по 20 штук в каждый и опустить в стакан со стерилизующим раствором, затем тщательно промыть бутоны (5–6 раз) стерильной дистиллированной водой.
2. Перенести бутоны на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, осторожно отделить пыльцевые мешки от тычиночных нитей.
3. Стерильной препарировальной иглой перенести пыльники на поверхность питательною среды в пробирки по 5-10 пыльников в каждую.
4. Закрыть пробирки и перенести в термостат с температурою 26 °Cи влажностью 70 %.
5. Результаты работы зарисовать через 2–4 недели.
Работа 2. ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИЗ ПЫЛЬЦЕВЫХ КАЛЛУСОВ ВИШНИ.
Объяснение. Способность каллусов к морфогенезу определяется балансом фитогормонов как в питатальных средах, так и в самих клетках (эндогенные фитогормоны). Для получения растений-регенерантов используют среды, содержащие кинетин — 0,1–0,3 мг/л, ГК — 4 мг/л, 6-БАП — 0,5–1,5 мг/л, ИУК — 0,5–1,5 мг/л. Каллусы культивируют при 16 часовом фотопериоде и интенсивностью освещения 2–3 kLx.
Морфогенный каллус имеет плотную консистенцию, бугристую поверхность, мо лочно-белый, желтоватый и зеленоватый цвет.
Поверхностные слои морфогенного каллуса состоят из меристематических, богатых цитоплазмою клеток, имеющих заполненные крахмалом пластиды и хорошо развитые митохондрии. Центральная часть каллуса представлена крупными вакуолизированными клетками с пикнотическими ядрами, которые чередуются с меристематическими участками.
Для индукции побегообразования, каллусы переносят на среды для регенерации: МС + кинетин — 1–2 мг/л, 6-БАП — 3–6 мг/л, аденин — 1–2 мг/л, ГК — 1–2 мг/л, феруловая кислота — 0,5–0,7 мг/л, ИУК — 0,2–0,4 мг/л, НУК — 0,2–0,4 мг/л, ИМК — 0,2–0,4 мг/л, 2,4-Д — 0,1–0,3 мг/л.
Через 1,5–2 месяца культивирования морфогенных каллусов на 16-ти часовом фотопериоде при освещенности 3 kLx начинается пролиферация почек и побегов. Морфогенные каллусы пассируют каждые 4–6 недель.
Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по морфологическим признакам. Это обусловлено гетерогенностью каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов и растений-регенерантов.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом, пробирки с пыльцевыми каллусами, пробирки со средами для получения морфогенного каллуса, пробирки со средами для регенерации, препарировальные иглы, пинцеты.
Ход работы.
1. В условиях ламинар-бокса извлечь каллус из пробирки и перенести на стерильную поверхность. Стерильной препарировальной иглой выделить зону морфогенного каллуса (белые мелкие клетки, каллус средней плотности).
2. Стерильной препарировальной иглой перенести кусочек (5–6 мм) морфоген ного каллуса в пробирку со средой для регенерации, закрыть пробирку стерильной пробкой.
3. Перенести штативы с пробирками в световую культуральную комнату с температурой 25 + 2 °C, влажностью 70 %, освещенностью 4 kLx.
4. Через 4–6 недель зарисовать результаты работы.
5. Побеги перенести в пробирки со средами для пролиферации побегов: МС +1–2 мг/л 6-ЕАП, 1 мг/л НУК.
6. Перенести побеги на среды для индукции корнеобразования: МС без гормонов, МС +1–2 мг/л ИМК + 1 мг/л ГК и поместить на 20 дней в темноту.
ТЕРМИНОЛОГИЯ
In vitro — выращивание растительных объектов «в стекле» (пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах, в асептических условиях.
Тотипотентность — свойство соматических клеток полностью реализовать генетический потенциал целого организма.
Омнипотентность ядер — сохранение ядрами соматических клеток растений всех потенций ядра зиготы, то есть сохранение всей генетической информации.
Культура тканей in vitro — выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов растений.
Культура органов in vitro — асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней, стеблевых апексов, незрелых частей цветка, незрелых плодов.
Культура корней in vitro — асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней.
Культура меристем in vitro — асептическое выращивание на искусственной питательной среде изолированного апекса или пазушной почки побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примордиями.
Культура суспензионная или культура клеток in vitro — асептическое выращивание отдельных клеток или их небольших групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде.
Культура зиготических зародышей in vitro — асептическое выращивание на искусственной питательной среде незрелых или зрелых изолированных зародышей.
Апекс — верхушечная часть стебля или корня.
Меристема — образовательная ткань с мелкими, активно делящимися клетками.
Апикальное доминирование — явление подавления роста боковых почек побега в присутствии терминальной почки.
Адвентивные почки — почки, возникшие из тканей и клеток растения, обычно их не образующих.
Фитогормоны — (гормоны растений) — биолигически активные соединения, образующиеся в растениях в малых количествах, вызывающие специфический ростовой или формообразовательный эффект.
Ауксины — фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие ррост стеблей и корней, стимулирующие образование корней у проростков.
Цитокинины — фитогормоны (кинетин, 6-ЕАП), активизирующие развитие
