Определение протеинов
Метод Кьельдаля . В колбу Кьельдаля емкостью 500 мл наливают определенное количество молока (5—10 г), добавляют 20 мл концентрированной серной кислоты и около 0,20 г сернокислой меди. Большую часть воды испаряют, оставляя смесь кипеть в продолжение 1–2 ч. После этого применяют методику Кьельдаля, как при исследовании плазмы (сыворотки) крови.
Вычисление . Умножают общий азот (N) на 6,38, чтобы получить содержание протеинов в исследуемом молоке. Множитель равен 6,38, так как общий белок молока содержит 15,7 % азота.
Разделение альбуминов и глобулинов производят, как в сыворотке крови.
Определение казеина
К 10,5 мл свежего молока в чашке Бехера прибавляют 90 мл теплой воды (40–42 °C) и 1,5 мл 10 %-ной уксусной кислоты и размешивают. Оставляют простоять 5 мин. и затем декантируют на промытый кислотой фильтр; промывают преципитат, декантируя несколько раз холодной водой. Переносят преципитат на фильтр и повторяют промывание еще два раза. Фильтрат должен быть прозрачным. Если первые порции не прозрачны, фильтрование и промывание повторяют.
Азотное содержание промытого преципитата определяют, как указано выше (см. определение протеинов).
Вычисление . Общий азот × 6,38 = содержание казеина (в определенном количестве молока).
Определение лактозы
Метод Бока (Bock) . Наливают точно 20 мл молока в волюметрическую колбу емкостью 100 мл. Добавляют пипеткой 12 мл 10 %-ного вольфрамата натрия и 12 мл серной кислоты. Размешивают, разводят до метки и фильтруют. Определяют лактозу путем титрования горячего фильтрата раствором Бенедикта, прибавляя 3–4 г безводного углекислого натрия. Титруют до исчезновения синего цвета.
Микроскопическое исследование молока
На очищенное предметное стекло капают пипеткой 1 каплю молока и покрывают покровным стеклом. Наблюдают под микроскопом при опущенном конденсоре. Видно множество жирных капель. При мастите в молоке можно видеть и лейкоциты.
Молоко представляет собой стабильную эмульсию молочных жиров в водном растворе. Стабильность эмульсии зависит не только от растворенных веществ, но главным образом от наличия белковой оболочки вокруг самых маленьких жировых капель. Диаметр капель жира колеблется от 0,5 до 20 микрон, причем большинство жировых шариков имеют диаметр 1–4 микрона. Они хорошо видны под микроскопом.
Глава 12. Исследование экссудатов и транссудатов
Исследование экссудатов и транссудатов . Полости организма покрыты серозными оболочками, состоящими из двух листков: парентерального и висцерального (наружного и внутреннего). Щелевидное пространство между этими листками называется серозной полостью. В этой полости имеется небольшое количество серозной жидкости, функция которой увлажнение соприкасающихся поверхностей. При некоторых патологических состояниях происходит скопление жидкости во внутренних полостях организма (например, экссудативный плеврит, экссудативный перикардит). Жидкости, образующиеся в результате воспалительного процесса, называются экссудатами. Жидкости, вырабатывающиеся вследствие нарушения кровообращения, – транссудаты.
Материал для исследования получают с помощью пункции. Задачами этого исследования являются:
1) определение характера выделенной жидкости (экссудат или транссудат);
2) в случае воспалительного происхождения жидкости определяют этиологию процесса (возбудитель).
Физико-химическое исследование . В физико-химическом исследовании важное значение имеет определение относительной плотности (удельного веса) и белка, так как эти показатели являются главными при отличии транссудатов от экссудатов. Удельный вес определяют с помощью ареометра или урометра малого размера. Относительная плотность транссудатов чаще ниже 1,015, реже – 1,013—1,025 (при сдавлении сосудов крупного калибра опухолью).
Удельный вес экссудатов больше – 1,015 (в среднем – 1,018– 1,022).
Белок определяют различными методами: рефрактометрическим, биуретовым, способом Робертса – Стольникова, гравиметрическим и др. В транссудатах содержание белка колеблется от 5 до 25 г/л (3 %), в экссудатах – 30–50 г/л (в гнойных экссудатах – до 80 г/л) (3–8 %). В транссудатах содержится большое количество альбуминов, а фибриногена крайне мало, поэтому свертывание транссудатов не происходит. В экссудате фибриногена значительно больше, что приводит к спонтанному свертыванию жидкости. В ряде случаев трудно отличить экссудаты от транссудатов, поэтому используют дополнительные пробы.
Проба Ривальты . В специальный цилиндр наливают воду, к которой добавляют несколько капель уксусной кислоты. В полученный раствор опускают каплю жидкости. Если это экссудат, то за каплей остается белый мутноватый след. Если же это транссудат – то никаких следов не отмечается.
Проба Лукерини . На часовом стекле к 2 мл 3 %-ного раствора перекиси водорода добавляют 1 каплю исследуемой жидкости. При воспалительном характере выпота (экссудат) отмечается опалесцирующее помутнение, которое отсутствует в случае транссудата.
Отношение содержания белка в исследуемой жидкости к уровню его в сыворотке крови у транссудатов – менее 0,5, у экссудатов – более 0,5.
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) в экссудатах – более 200 МЕ/л, в транссудатах – менее 200 МЕ/л.
Отношение уровня ЛДГ в исследуемом выпоте (сыворотке крови) у транссудатов составляет менее 0,6, у экссудатов – более 0,6.
Концентрация сахара в транссудатах такая же, как и в сыворотке крови (4,6–6,4 ммоль/л), а в выпотах воспалительного характера – несколько ниже.
Макроскопическое исследование
Внешний вид исследуемой жидкости зависит от ее химического и клеточного состава.
Прозрачность и цвет . Серозные экссудаты и транссудаты обычно прозрачны, могут слегка опалесцировать, светло-желтого или лимонно-желтого оттенка. Другие варианты экссудатов мутные, их цвет зависит от характера жидкости.
Консистенция выпотов обычно жидкая. Гнойный экссудат более густой (сливкообразный), с трудом проходящий через иглу при пункции.
Запахом обычно жидкости не обладают, за исключением гнилостных экссудатов (например, при гангрене легкого экссудат скапливается в плевральной полости). Запах зловонный, неприятный – обусловлен распадом белковых молекул вследствие воздействия ферментов (анаэробных бактерий).
Микроскопическое исследование
Микроскопическому исследованию подвергается осадок исследуемой жидкости, полученный при кратковременном центрифугировании (не более 5 мин.). Экссудат в течение центрифугирования может свернуться, и полученный осадок будет непригоден для микроскопии, так как большая часть клеточных элементов захватывается в таких случаях сгустком. С целью профилактики свертывания в исследуемую жидкость добавляют гепарин или цитрат натрия.
Клеточный состав выпота изучают различными способами: готовят нативные (свежие) препараты, сухие мазки, мазки, окрашенные по Папаниколау или Романовскому – Гимзе; анализ жидкости опухолевой природы осуществляют с помощью флуоресцентной микроскопии; гистологическое исследование.
Чтобы приготовить нативный препарат, каплю осадка наносят на предметное стекло и покрывают покровным стеклом. Затем полученный препарат изучают в простом или фазоконтрастном микроскопе. Анализируют количество клеточных и форменных элементов. Возможно наличие небольшого числа эритроцитов за счет примеси крови при проколе иглой, но их много содержится в геморрагическом экссудате, при инфаркте легкого, например при травме.
Лейкоциты выглядят так же, как и в кровяном русле.
Нейтрофилы встречаются такие же, как и в крови и с элементами дегенерации. В начальной стадии воспалительного процесса содержание нейтрофилов составляет 50–80 % от всего клеточного состава. При благоприятном течении концентрация нейтрофилов снижается, при неблагоприятном (гнойное воспаление) – их уровень резко увеличивается.
Лимфоциты появляются в выпотах спустя 1–2 недели после начала заболевания. В случае туберкулеза в разгар заболевания их уровень намного выше, чем содержание других клеточных элементов. Возможно наличие в исследуемых жидкостях эозинофилов.
Моноциты встречаются как в экссудатах, так и в транссудатах. В выпотах могут иметь другую форму, в отличие от крови. Ядро более четкое, с густой сетью хроматина.
Плазматические клетки могут присутствовать при затяжных вариантах плеврита туберкулезного происхождения, а также в геморрагических экссудатах в резорбтивную стадию.
Макрофаги – это клетки более крупных размеров с вакуолями в протоплазме. Их ядро чаще вытянуто, изогнуто, с большим количеством хроматина. В протоплазме часто обнаруживаются фагоцитированные лейкоциты, эритроциты. В отдельных макрофагах ядро вакуолью сдвинуто к периферии клетки, вследствие чего она приобретает перстневидную форму.
